Mikrodissektion af musehjerne i funktionelt og anatomisk forskellige regioner

Summary

Vi præsenterer en praktisk, trin-for-trin, hurtig protokol til fjernelse af musehjerne og dissektion af diskrete områder fra frisk hjernevæv. At opnå hjerneområder til molekylær analyse er blevet rutine i mange neurovidenskabslaboratorier. Disse hjerneområder fryses straks for at opnå transkriptomiske data af høj kvalitet til analyse på systemniveau.

Abstract

Hjernen er kommandocentral for pattedyrs nervesystem og et organ med enorm strukturel kompleksitet. Beskyttet i kraniet består hjernen af et ydre dække af gråt stof over halvkuglerne kendt som hjernebarken. Under dette lag ligger mange andre specialiserede strukturer, der er afgørende for flere fænomener, der er vigtige for eksistensen. Erhvervelse af prøver af specifikke grove hjerneområder kræver hurtige og præcise dissektionstrin. Det er underforstået, at der på mikroskopisk niveau findes mange underregioner og sandsynligvis krydser de vilkårlige regionale grænser, som vi pålægger med henblik på denne dissektion.

Musemodeller bruges rutinemæssigt til at studere menneskelige hjernefunktioner og sygdomme. Ændringer i genekspressionsmønstre kan begrænses til specifikke hjerneområder rettet mod en bestemt fænotype afhængigt af den syge tilstand. Det er således af stor betydning at studere regulering af transkription med hensyn til dens veldefinerede strukturelle organisation. En fuldstændig forståelse af hjernen kræver at studere forskellige hjerneområder, definere forbindelser og identificere nøgleforskelle i aktiviteterne i hver af disse hjerneområder. En mere omfattende forståelse af hver af disse forskellige regioner kan bane vejen for nye og forbedrede behandlinger inden for neurovidenskab. Heri diskuterer vi en trin-for-trin metode til dissekering af musehjernen i seksten forskellige regioner. I denne procedure har vi fokuseret på hanmus C57Bl/6J (6-8 uger gammel) hjernefjernelse og dissektion i flere regioner ved hjælp af neuroanatomiske landemærker til at identificere og prøve diskret funktionelt relevante og adfærdsmæssigt relevante hjerneområder. Dette arbejde vil hjælpe med at lægge et stærkt fundament inden for neurovidenskab, hvilket fører til mere fokuserede tilgange i den dybere forståelse af hjernens funktion.

Introduction

Hjernen udgør sammen med rygmarven og nethinden centralnervesystemet, der udfører kompleks adfærd, styret af specialiserede, præcist placerede og interagerende celletyper i hele kroppen¹. Hjernen er et komplekst organ med milliarder af sammenkoblede neuroner og glia med præcise kredsløb, der udfører adskillige funktioner. Det er en bilateral struktur med to forskellige lobes og forskellige cellulære komponenter². Rygmarven forbinder hjernen med omverdenen og er beskyttet af knogler, hjernehinder og cerebrospinalvæske og dirigerer beskeder til og fra hjernen ^2,3,4. Hjernens overflade, hjernebarken, er ujævn og har forskellige folder, kaldet gyri, og riller, kaldet sulci, der adskiller hjernen i funktionelle centre⁵. Cortex er glat hos pattedyr med en lille hjerne ^6,7. Det er vigtigt at karakterisere og studere arkitekturen i den menneskelige hjerne for at forstå de lidelser, der er relateret til de forskellige hjerneområder, såvel som dets funktionelle kredsløb. Neurovidenskabelig forskning er udvidet i de senere år, og en række eksperimentelle metoder bruges til at studere hjernens struktur og funktion. Udviklingen inden for molekylær- og systembiologi har indvarslet en ny æra med udforskning af det komplekse forhold mellem hjernestrukturer og molekylers funktion. Derudover vokser molekylærbiologi, genetik og epigenetik hurtigt, hvilket gør det muligt for os at fremme vores viden om de underliggende mekanismer, der er involveret i, hvordan systemer fungerer. Disse analyser kan udføres på et meget mere lokaliseret grundlag for at hjælpe med at målrette undersøgelsen og udviklingen af mere effektive terapier.

Pattedyrshjernen er strukturelt defineret i klart identificerbare diskrete regioner; imidlertid er de funktionelle og molekylære kompleksiteter af disse diskrete strukturer endnu ikke klart forstået. Hjernevævets flerdimensionelle og flerlagede natur gør dette landskab vanskeligt at studere på funktionsniveau. Hertil kommer, at det faktum, at flere funktioner udføres af samme struktur og omvendt, yderligere komplicerer forståelsen af hjernen⁸. Det er afgørende, at den eksperimentelle tilgang, der udføres til strukturel og funktionel karakterisering af hjerneområder, bruger præcise forskningsmetoder til at opnå konsistens i prøveudtagning for korrelerende neuroanatomisk arkitektur med funktion. Hjernens kompleksitet er for nylig blevet forklaret ved hjælp af enkeltcellesekventering ^9,10, såsom den tidlige gyrus i den menneskelige hjerne, der består af 75 forskellige celletyper¹¹. Ved at sammenligne disse data med dem fra en analog region i musehjernen afslører undersøgelsen ikke kun ligheder i deres arkitektur og celletyper, men præsenterer også forskellene. For at opklare de komplekse mekanismer er det derfor vigtigt at studere forskellige områder af hjernen med fuld præcision. Bevarede strukturer og funktion mellem en menneske- og musehjerne muliggør brugen af en mus som en foreløbig surrogat til belysning af menneskelig hjernefunktion og adfærdsmæssige resultater.

Med udviklingen af systembiologiske tilgange er indhentning af information fra diskrete hjerneområder hos gnavere blevet en nøgleprocedure inden for neurovidenskabelig forskning. Mens nogle protokoller såsom laser capture mikrodissektion¹² kan være dyre, er mekaniske protokoller billige og udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige værktøjer^13,14. Vi har brugt flere hjerneområder til transkriptomiske assays¹⁵ og har udviklet en praktisk og hurtig procedure til at dissekere musehjerneområder af interesse på en trinvis måde på kort tid. Når dissekeret, kan disse prøver opbevares straks under kolde forhold for at bevare nukleinsyrer og proteiner i disse væv. Vores tilgang kan udføres hurtigere, hvilket fører til høj effektivitet og giver mindre chancer for vævsforringelse. Dette øger i sidste ende chancerne for at generere reproducerbare eksperimenter af høj kvalitet ved hjælp af hjernevæv.

Protocol

Dyrehåndterings- og forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med europæiske, nationale og institutionelle retningslinjer for dyrepleje. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved US Army Center for Environmental Health Research nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) og udført i et anlæg akkrediteret af Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).BEMÆRK: Proceduren vil blive udført på seks t…

Representative Results

Vores forståelse af hjernens komplekse struktur og funktion udvikler sig hurtigt og forbedres. Hjernen indeholder flere forskellige regioner, og opbygning af et molekylært kort kan hjælpe os med bedre at forstå, hvordan hjernen fungerer. I dette metodepapir har vi diskuteret dissektion af musehjernen i flere forskellige regioner (tabel 1). I denne protokol identificeres strukturerne baseret på de kritiske landemærker og opnås ved at holde vævet fugtigt med saltopløsning ved at bevare dets robust…

Discussion

Pattedyrshjernen er et komplekst organ sammensat af en række morfologisk forskellige og funktionelt unikke celler med forskellige molekylære signaturer og flere regioner, der udfører specialiserede og diskrete funktioner. Dissektionsproceduren, der er rapporteret her, kan have flere mål afhængigt af laboratoriets krav. I vores laboratorium vurderede vi transkription i flere hjerneområder indsamlet fra mus udsat for PTSD som stress¹⁶ . Vi vil gerne undersøge yderligere virkningen af stammege…

Materials

Brain Removal
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6762	5.5" straight sharp/sharp
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6763	5.5" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6703	4.75" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6702	4.75" straight sharp/sharp
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved Sharp/Sharp
Micro spatula, radius and tapered flat ends			stainless steel mirror finish
Operating scissors 6.5"	Roboz Surgical Store	RS-6846	curved sharp/sharp
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160	4.5” 1X2 teeth 2mm tip width
Rongeur (optional)	Roboz Surgical Store	RS-8321 many styles to choose	Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades	Roboz Surgical Store	RS-9801-11	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Super fine forceps Inox	Roboz Surgical Store	RS-4955	tip size 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A magnification visor	Penn Tool Col	40-178-6	2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier
Dissection cold plate	Cellpath.com	JRI-0100-00A	Iceberg cold plate & base
Graefe forceps, full curve extra delicate	Roboz Surgical Store	RS-5138	0.5 mm Tip 4” (10 cm) long
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved sharp/sharp
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843 (repeated above)	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades (especially #11)	Roboz Surgical Store	RS-9801-11 (repeated above)	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Spatula	Amazon	MS-SQRD9-4	Double Ended Spatula Square AND Round End
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160 (repeated above)	4.5” 1X2 teeth