Vi leverer en detaljeret protokol for elektroporation-medieret RNA interferens i insekter af ordren Odonata (guldsmede og damselflies) ved hjælp af blå-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) og pied skiflue guldsmed guldsmed (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anptisoera).
Guldsmede og damselflies (orden Odonata) repræsenterer en af de mest forfædres insekter med metamorfose, hvor de ændrer deres levesteder, morfologi, og adfærd drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne uden pupal fase. Odonata voksne har en veludviklet farve vision og viser en bemærkelsesværdig mangfoldighed i kroppens farver og mønstre på tværs af køn, stadier og arter. Mens mange økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser på Odonata er blevet gennemført, molekylære genetiske undersøgelser har været knappe primært på grund af vanskelighederne med at anvende gen funktionelle analyse til Odonata. For eksempel er RNA-interferens (RNAi) mindre effektiv i Odonata, som rapporteret i Lepidoptera. For at løse dette problem, vi med succes etableret en RNAi metode kombineret med in vivo elektroporation. Her giver vi en detaljeret protokol, herunder en video af den elektroporation-medieret RNAi metode som følger: forberedelse af larver, art identifikation, forberedelse af dsRNA / siRNA løsning og injektion nåle, iskold anæstesi af larver, dsRNA / siRNA injektion, in vivo elektroporation, og individuel opdræt indtil voksne fremkomsten. Den elektroporation-medieret RNAi metode gælder for både damselflies (underorden Zygoptera) og guldsmede (underorden Anisoptera). I denne protokol præsenterer vi metoderne for den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som et eksempel på damselfly arter og pied skimmer guldsmed Pseudothemis zonata (Libellulidae) som et andet eksempel på guldsmed arter. Som repræsentative eksempler viser vi resultaterne af RNAi rettet mod melaninsyntesegen multicopper oxidase 2. Denne RNAi metode vil lette forståelsen af forskellige genfunktioner involveret i metamorfose, morfosese, farvemønster dannelse, og andre biologiske træk ved Odonata. Desuden kan denne protokol generelt anvendes på ikke-modelorganismer, hvor RNAi er mindre effektivt til genundertrykkelse på grund af ineffektivitet og lav penetrance.
Guldsmede og damselflies (rækkefølgen Odonata) er blandt de mest forfædre grupper af insekter, der udviser “metamorfose”1,2. Ved metamorfose, de ændrer deres levested, morfologi, og adfærd drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne3. Odonata voksne har en veludviklet farve vision og repræsenterer en bemærkelsesværdig mangfoldighed i kroppens farver og mønstre på tværs af køn, stadierogarter3,4,5. Mens mange økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser på Odonata er blevetgennemført 6,7, molekylære genetiske undersøgelser er blevet hæmmet primært af vanskelighederne med at anvende gen funktionelle analyse til Odonata.
Den konventionelle RNA interferens (RNAi) metode, hvor dobbeltstrenget RNA (dsRNA) injiceres for at undertrykke funktionen af genet af interesse8, viste sig at være ineffektiv i Odonata insekter9, som rapporteret i Lepidopteran insekter10. På den anden side, tidligere rapporter har antydet, at elektroporation-medieret RNAi er effektiv i Lepidopteran arter, især i epidermal væv11,12,13. Vi har for nylig konstateret, at den elektroporation-medieret RNAi fungerer effektivt i den lille guldsmed Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea er en relativt sjælden art og derfor ikke egnet til molekylære genetiske undersøgelser.
De fleste Odonata arter er klassificeret i en af de to underordener, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (ægte guldsmede)3. Her fokuserede vi på den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figur 1A) som en repræsentativ Zygopteran art og pied skimmer guldsmed Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figur 1B) som en repræsentativ anisopteran art. De to arter er blandt de mest almindelige Odonata arter i naturlige og urbane damme i Japan, herunder dem i Tsukuba City, og vi kan samle mange larver af de to arter i marken. For nylig etablerede vi et laboratorieopdrætssystem for individuelle larver af I. senegalensis, som muliggjorde løbende overvågning af udvikling og morfogenese af Odonata larver i detaljer14.
I denne rapport, vi giver en raffineret metode og en video protokol for elektroporation-medieret RNAi i I. senegalensis og P. zonata. I Japan, I. senegalensis og Ischnura asiatica, som er genetisk tæt, findes ofte sympatrically15, og de er vanskelige at skelne i larver16. Vi beskriver også, hvordan to Ischnura arter kan skelnes ved begrænsning fragment længde polymorfi (RFLP).
Til vurdering af effektiviteten af den elektroporation-medieret RNAi, vælger vi multicopper oxidase 2 gen (MCO2; også kendt som laccase2) som et repræsentativt mål gen, på grund af den synlige fænotype af lysere neglebånd farve ved knockdown af genet udtryk9. MCO2 er kendt for at være afgørende for mørkfaring af epidermis i en række insektarter17,18.
Dødelighed af RNAi behandling
Vi fandt, at dødeligheden af RNAi behandling afhænger stærkt af opdræt historie og tilstand af Odonata larver. Larverne kort efter indsamling i marken er generelt sunde og udviser lav dødelighed efter den elektroporation-medieret RNAi behandling. Derimod har de larver, der opdrættes i laboratoriet i en lang periode (f.eks. en måned), en tendens til at lide under lave succesrater for voksnes opståen. I. senegalensis, i stedet for larver indsamlet i marken, larver opdrættet i laboratoriet fra æg kan anvendes14, men succesraten for RNAi ved hjælp af laboratorieopdrættet larver tendens til at være betydeligt lavere (mange personer døde under metamorfose) end dem, der bruger felt-indsamlede larver. Desuden er hyppig larvefodring og ren vandopdragelse vigtige for at øge succesraten for voksnes opståen og reducere dødeligheden af RNAi-behandlingen.
Effektiviteten af RNAi-behandling
Som beskrevet ovenfor udviste niveauerne af RNAi fænotype, nemlig størrelse og placering af neglebåndsdecoloriseringen, ofte betydelig variation mellem personer, der udsættes for den samme RNAi-behandling (f.eks. figur 4), men niveauerne af fænotypepensypenpicetrance synes at være bemærkelsesværdigt forskellige mellem Odonata-arterne. De observerede fænotopypiske regioner var større og mere fremtrædende i I. senegalensis (Figur 4-5) end i P. zonata (figur 6) og N. pygmaea9. Denne forskel kan skyldes tykkelsen af neglebånd på larve overfladen, i betragtning af at neglebånd af I. senegalensis er tyndere end neglebånd af P. zonata og N. pygmaea). Så vidt vi undersøgte, blev der ikke erkendt nogen klar forskel mellem virkningerne af siRNA og dsRNA (Figur 4, Tabel 1).
Passende udviklingsfase for RNAi
Det skal bemærkes, at korrekt larve iscenesættelse er vigtigt for at udføre RNAi effektivt. Hæmning af voksen pigmentering var forårsaget af MCO2 RNAi før fase D (ca. 3 dage før voksne fremkomst), hvilket er i overensstemmelse med den tidligere rapport om N. pygmaea9. De RNAi fænotyper, der blev observeret ved injektion i fase C og D, var mindre iøjnefaldende end dem, der blev behandlet i fase A og B, hvilket indikerer, at fase C og D kan være for sent til tilstrækkeligt at undertrykke genekspressionen. Den rette timing for RNAi-behandling afhænger af tidspunktet for genekspression, og MCO2-genet udviser forbigående højt udtryk under voksenspiring9som i andre insekter17,18. I stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown af MCO2 genet blev observeret fra dag 4 og fremefter efter injektion27, hvilket er i overensstemmelse med de nuværende resultater.
Vores tidligere undersøgelse af I. senegalensis viste, at efter fase B, dage til voksne fremkomsten udviser relativt lille variation blandt de fleste af de endelige instar larver, hvilket tyder på, at fase B kan svare til starten af processen mod voksne fremkomst, hvorefter de udviklingsmæssige processer for metamorfose fortsætte i en præfiks og koordineret måde14. Morfologiske abnormiteter forårsaget af sår blev ofte observeret, når larverne blev RNAi-behandlet i fase C og D (Figur 7B, 7C). Dette vil sandsynligvis være forbundet med en dramatisk progression af metamorfose i disse faser, hvilket tyder på, at RNAi behandling bør undgås fra fase C og videre. Sammenfattende anbefaler vi, at endelige instar larver på trin A eller B (eller på det stadium, før larvevinger udvide betydeligt) bør anvendes til RNAi eksperimenter.
Nytte og overlegenhed af elektroporation-medieret RNAi metode
Den konventionelle RNAi er en enkel og kraftfuld eksperimentel metode, men nogle insekt slægter som sommerfugle10, bladlus28 og guldsmede9 udviser lav RNAi effektivitet, for hvilke etablering af genfunktion analyse er en stor udfordring. I denne undersøgelse fandt vi, at elektroporation-medieret RNAi kan fremkalde lokale gen undertrykkelse i guldsmede med næsten 100% effektivitet, i det mindste i epidermis, hvis de behandles på passende udviklingsstadier (Tabel 1). For nylig, CRISPR/Cas9-baserede gen knockouts er blevet anvendt med succes på en række insekter, hvilket giver en kraftfuld molekylær genetisk værktøj til ikke-model organismer29. Her påpeger vi dog, at CRISPR/Cas9 helt sikkert er fantastisk, men den elektroporation-medieret RNAi-metode kan være bedre end CRISPR/Cas9 i nogle henseender.
For det første kan den karrosseriregion, hvor RNAi fænotyper vises, nemt styres eksperimentelt ved placeringen af den positive elektrode ved elektroporation. Da den region, hvor genekspressionen undertrykkes, er begrænset omkring den region, hvor den positive elektrode blev placeret, kan RNAi fænotyperne let sammenlignes med kontrolfenotyperne side om side i samme individ. For det andet, sammenlignet med CRISPR/Cas9-metoden, hvor indsprøjtede æg skal opdrættes til voksenalderen for at observere knockout-fænotyperne, er den elektroporation-medieret RNAi overlegen, da genet knockdown fænotyper normalt kan observeres på meget kortere tid. For eksempel tager det tre til fire måneder for I. senegalensis og et til to år for P. zonata fra æg til voksne14,30. Men for at observere RNAi fænotyper inden for den voksne epidermis, det tager mindre end en måned fra dsRNA injektion i den endelige instar larver på trin B til voksne fremkomsten for både I. senegalensis og P. zonata (Figur 7). For det tredje indebærer den elektroporation-medieret RNAi-metode dsRNA-injektion i store larver, hvilket er lettere end mikroinjektion i bittesmå æg, der kræves til CRISPR/Cas9-metoden. Desuden gælder den elektroporationsmedierede RNAi for insektarter, hvis nylagte æg er vanskelige at indsamle. For eksempel lægger hunnerne af P. zonata æg på flydende planter på vandoverfladen under flyvningen, og derfor er det svært at samle deres æg både i marken og i laboratoriet. Derfor forventer vi, at denne protokol kan være generelt gældende for ikke-model organismer, hvor den konventionelle RNAi metode ikke fungerer effektivt.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Minoru Moriyama for teknisk rådgivning og støtter, Bin Hirota og Ryutaro Suzuki for indsamling Odonata larver, og Misa Shinya for nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 til GO og JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 og JP20H04936 til RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |