Vi gir en detaljert protokoll for elektroporasjon-mediert RNA interferens i insekter av ordenen Odonata (øyenstikkere og damselflies) ved hjelp av blå-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) og pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Dragonflies og damselflies (orden Odonata) representerer et av de mest forfedrenes insekter med metamorfose, der de endrer sitt habitat, morfologi og oppførsel drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne uten pupal stadium. Odonata voksne har et velutviklet fargesyn og viser et bemerkelsesverdig mangfold i kroppsfarger og mønstre på tvers av kjønn, stadier og arter. Mens mange økologiske og atferdsstudier på Odonata har blitt utført, molekylære genetiske studier har vært knappe hovedsakelig på grunn av vanskeligheten med å bruke genfunksjonell analyse til Odonata. For eksempel er RNA-interferens (RNAi) mindre effektiv i Odonata, som rapportert i Lepidoptera. For å overvinne dette problemet etablerte vi en RNAi-metode kombinert med in vivo elektroporasjon. Her gir vi en detaljert protokoll, inkludert en video av elektroporasjonsmediert RNAi-metoden som følger: fremstilling av larver, artsidentifikasjon, fremstilling av dsRNA/ siRNA-løsning og injeksjonsnåler, iskald anestesi av larver, dsRNA / siRNA-injeksjon, in vivo elektroporasjon og individuell oppdrett til voksen fremvekst. Den elektroporasjonsmedierte RNAi-metoden gjelder for både damselflies (underbestilling Zygoptera) og øyenstikkere (underordnede Anisoptera). I denne protokollen presenterer vi metodene for den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som et eksempel på damselfly arter og pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) som et annet eksempel på dragonfly arter. Som representative eksempler viser vi resultatene av RNAi rettet mot melaninsyntesegen multicopper oxidase 2. Denne RNAi-metoden vil lette forståelsen av ulike genfunksjoner involvert i metamorfose, morfogenese, fargemønsterdannelse og andre biologiske egenskaper ved Odonata. Videre kan denne protokollen være generelt aktuelt for ikke-modellorganismer der RNAi er mindre effektiv i genundertrykkelse på grunn av ineffektivitet og lav penetrance.
Dragonflies og damselflies (rekkefølgen Odonata) er blant de mest forfedres grupper av insekter som viser “metamorfose”1,2. Ved metamorfose endrer de sitt habitat, morfologi og oppførsel drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne3. Odonata voksne har et velutviklet fargesyn og representerer et bemerkelsesverdig mangfold i kroppsfarger og mønstre på tvers av kjønn, stadier ogarter 3,4,5. Mens mange økologiske og atferdsstudier på Odonata har blittutført 6,7, molekylære genetiske studier har blitt hindret hovedsakelig av vanskeligheten med å bruke genfunksjonell analyse til Odonata.
Den konvensjonelle RNA interferens (RNAi) metoden, der dobbelttrådet RNA (dsRNA) injiseres for å undertrykke funksjonen til genet av interesse8, viste seg å være ineffektiv i Odonata insekter9, som rapportert i Lepidopteran insekter10. På den annen side har tidligere rapporter antydet at elektroporasjonsmediert RNAi er effektiv i lepidopteriske arter, spesielt i epidermal vev11,12,13. Vi fant nylig at elektroporasjon-mediert RNAi fungerer effektivt i den lille dragonfly Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea er en relativt sjelden art og derfor ikke egnet for molekylære genetiske studier.
De fleste Odonata arter er klassifisert i en av de to underbestillinger, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (sanne øyenstikkere)3. Her fokuserte vi på den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figur 1A) som en representant Zygopteran arter og pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figur 1B) som en representativ anisopteran art. De to artene er blant de vanligste Odonata-artene i naturlige og urbane dammer i Japan, inkludert de i Tsukuba By, og vi kan samle mange larver av de to artene i feltet. Nylig etablerte vi et laboratorieoppdragssystem for individuelle larver av I. senegalensis, som gjorde det mulig kontinuerlig overvåking av utvikling og morfogenese av Odonata larver i detalj14.
I denne rapporten gir vi en raffinert metode og en videoprotokoll for elektroporasjonsmedierte RNAi i I. senegalensis og P. zonata. I Japan finnes I. senegalensis og Ischnura asiatica, som er genetisk nær, ofte sympatrisk15, og de er vanskelige å skille mellomi larver 16. Vi beskriver også hvordan to Ischnura arter kan skilles ved begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP).
For å evaluere effektiviteten av elektroporasjonsmedierte RNAi, velger vi multicopper oxidase 2 genet (MCO2; også kjent som laccase2) som et representativt målgen, på grunn av den synlige fenotypen av blekere cuticle farge ved knockdown av genuttrykket9. MCO2 er kjent for å være avgjørende for mørkere epidermis i en rekke insektarter17,18.
Dødelighet av RNAi behandling
Vi fant at dødeligheten av RNAi-behandlingen avhenger sterkt av oppdrettshistorien og tilstanden til Odonata larver. Larvene kort tid etter innsamling i feltet er generelt sunne og viser lav dødelighet etter elektroporasjonsmediert RNAi-behandling. Derimot har larvene oppdratt i laboratoriet i lang tid (f.eks. en måned) en tendens til å lide lave suksessrater for voksen fremvekst. I I. senegalensis, i stedet for larver samlet i feltet, kan larvene oppdratt i laboratoriet fra egg brukes14, men suksessratene til RNAi ved hjelp av laboratorie-oppdrettede larver har en tendens til å være betydelig lavere (mange individer døde under metamorfose) enn de som bruker de feltsamlede larver. I tillegg er hyppig larvefôring og ren vannoppdring viktig for å øke suksessratene for voksen fremvekst og redusere dødeligheten av RNAi-behandlingen.
Effektiviteten av RNAi behandling
Som beskrevet ovenfor, nivåene av RNAi fenotype, nemlig størrelse og plassering av cuticle decolorization, viste ofte betydelig variasjon mellom individer utsatt for samme RNAi behandling (f.eks Figur 4),men nivåene av fenotypisk penetrering synes å være bemerkelsesverdig forskjellig mellom Odonata arter. De observerte fenotypiske regionene var større og mer fremtredende i I. senegalensis (Figur 4-5) enn i P. zonata (figur 6) og N. pygmaea9. Denne forskjellen kan skyldes tykkelsen på skjellaget på larvaloverflaten, med tanke på at skjellaget av I. senegalensis er tynnere enn skjellaget av P. zonata og N. pygmaea). Så vidt vi undersøkte, ble det ikke gjenkjent noen klar forskjell mellom effekten av siRNA og dsRNA (figur 4, tabell 1).
Passende utviklingsstadium for RNAi
Det bør bemerkes at riktig larval iscenesettelse er viktig for å utføre RNAi effektivt. Hemming av voksenpigmentering var forårsaket av MCO2 RNAi før trinn D (ca. 3 dager før voksen fremvekst), noe som er i samsvar med den forrige rapporten om N. pygmaea9. RNAi fenotypene observert når de injiseres i trinn C og D var mindre iøynefallende enn de som ble behandlet i stadiene A og B, noe som indikerer at stadier C og D kan være for sent til å tilstrekkelig undertrykke genuttrykket. Riktig tidspunkt for RNAi-behandling avhenger av tidspunktet for genuttrykk, og MCO2-genet viser forbigående høyt uttrykk under voksen fremvekst9, som i andreinsekter 17,18. I stinkbug Plautia stalible RNAi knockdown av MCO2 genet observert fra dag 4 og utover etter injeksjon27, noe som er i samsvar med dagens resultater.
Vår tidligere studie på I. senegalensis viste at etter stadium B viser dager til voksen fremvekst relativt liten variasjon blant flertallet av endelige instar larver, noe som tyder på at stadium B kan tilsvare utbruddet av prosessen mot voksen fremvekst, hvoretter utviklingsprosessene for metamorfose fortsetter på en prefiks og koordinertmåte 14. Morfologiske abnormiteter forårsaket av sår ble ofte observert når larvene ble RNAi-behandlet i stadiene C og D (figur 7B, 7C). Dette vil sannsynligvis være forbundet med en dramatisk progresjon av metamorfose i disse stadiene, noe som tyder på at RNAi behandling bør unngås fra stadium C og videre. Oppsummert anbefaler vi at endelige instar larver på scenen A eller B (eller på scenen før larvevingene utvides betydelig) skal brukes til RNAi-eksperimenter.
Nytten og overlegenheten til elektroporasjonsmediert RNAi-metode
Den konvensjonelle RNAi er en enkel og kraftig eksperimentell metode, men noen insektslektninger somsommerfugler 10,bladlus28 og øyenstikkere9 viser lav RNAi effektivitet, som etablering av genfunksjonsanalyse er en stor utfordring. I denne studien fant vi at elektroporasjonsmediert RNAi kan indusere lokal genundertrykkelse i øyenstikkere med nesten 100% effektivitet, i hvert fall i epidermis, hvis behandlet på passende utviklingsstadier (tabell 1). Nylig har CRISPR / Cas9-baserte gen knockouts blitt brukt på en rekke insekter, noe som gir et kraftig molekylært genetisk verktøy for ikke-modellorganismer29. Her påpeker vi imidlertid at CRISPR/Cas9 er absolutt flott, men elektroporasjonsmediert RNAi-metoden kan være bedre enn CRISPR/Cas9 i noen henseender.
For det første, i elektroporasjonsmediert RNAi-metoden, kan kroppsområdet der RNAi fenotyper vises lett kontrolleres eksperimentelt ved posisjonen til den positive elektroden ved elektroporasjon. I tillegg, siden regionen der genuttrykket undertrykkes er begrenset rundt regionen der den positive elektroden ble plassert, kan RNAi fenotypene enkelt sammenlignes med kontrollfenotypene side om side i samme individ. For det andre, sammenlignet med CRISPR/Cas9-metoden der injiserte egg må oppdras til voksen alder for å observere knockout fenotypene, er elektroporasjonsmediert RNAi overlegen ved at genet knockdown fenotyper vanligvis kan observeres på mye kortere tid. For eksempel tar det tre til fire måneder for I. senegalensis og ett til to år for P. zonata fra egg tilvoksne 14,30. Men for å observere RNAi fenotyper innenfor den voksne epidermis, tar det mindre enn en måned fra dsRNA injeksjon til endelig instar larver på stadium B til voksen fremvekst for både I. senegalensis og P. zonata (Figur 7). For det tredje innebærer den elektroporasjonsmedierte RNAi-metoden dsRNA-injeksjon i store larver, noe som er lettere enn mikroinjeksjon i små egg som kreves for CRISPR/ Cas9-metoden. I tillegg gjelder den elektroporasjonsmedierte RNAi for insektarter hvis nylagte egg er vanskelige å samle. For eksempel legger kvinner av P. zonata egg på flytende planter på vannoverflaten under flyturen, og dermed er det vanskelig å samle eggene sine både i feltet og i laboratoriet. Derfor forventer vi at denne protokollen generelt kan gjelde for ikke-modellorganismer der den konvensjonelle RNAi-metoden ikke fungerer effektivt.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Minoru Moriyama for tekniske råd og støtter, Bin Hirota og Ryutaro Suzuki for å samle Odonata larver, og Misa Shinya for nyttige kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 til GO og JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 og JP20H04936 til RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |