Forberedelse af planteprøve til måling af nukleoside/nukleotidindhold med en HPLC-MS/MS
Summary
En præcis og reproducerbar metode til in vivo nukleotider/nukleotider kvantificering i planter er beskrevet her. Denne metode anvender en HPLC-MS/MS.
Abstract
Nukleotider/nukleotider er byggesten af nukleinsyrer, dele af cosubstrater og coenzymer, cellesignaleringsmolekyler og energibærere, som er involveret i mange celleaktiviteter. Her beskriver vi en hurtig og pålidelig metode til absolut kvalificering af nukleoside/nukleotidindhold i planter. Kort sagt blev 100 mg homogeniseret plantemateriale udvundet med 1 ml ekstraktionsbuffer (methanol, acetonionstrid og vand i et forhold på 2:2:1). Senere blev prøven koncentreret fem gange i en frysetørrer og derefter injiceret i en HPLC-MS/MS. Nukleotider blev adskilt på en porøs grafitisk kulstof (PGC) kolonne og nukleotider blev adskilt på en C18 kolonne. Masseovergangene for hver nukleoside og nukleotid blev overvåget af massespektrometri. Indholdet af nukleotider og nukleotider blev kvantificeret i forhold til deres eksterne standarder (ESTD’er). Ved hjælp af denne metode kan forskere derfor nemt kvantificere nukleotider / nukleotider i forskellige planter.
Introduction
Nukleotider/nukleotider er centrale metaboliske komponenter i alle levende organismer, som er forløbere for nukleinsyrer og mange coenzymer, såsom nicotinamid-adenin dinukleotid (NAD), og vigtige i syntesen af makromolekyler såsom fosfolipider, glykolipider og polysaccharider. Strukturelt indeholder nukleoside en nukleobase, som kan være en adenin, guanine, uracil, cytosin eller thymine og en sukkergeiety, som kan være en ribose eller en deoxyribose1,2. Nukleotider har op til tre fosfatgrupper, der binder sig til 5-carbon-positionen af nukleososidernes sukkermoiety3. Metabolismen af nukleotider i planter er afgørende for frøspiring og bladvækst4,5,6. For bedre at forstå deres fysiologiske roller i planteudviklingen bør metoderne til absolut kvantificering af forskellige nukleotider/nukleotider in vivo fastlægges.
En af de mest anvendte metoder til måling af nukleotider/nukleotider anvender en højtydende væskekromatografi (HPLC) kombineret med en ultraviolet-synlig (UV-VIS) detektor4,7,8,9,10,11. I 2013 kvantificerede ved hjælp af HPLC, Dahncke og Witte flere typer af nukleosiderne i Arabidopsis thaliana7. De identificerede et forbedret guanosinindhold i en T-DNA-indsættelsesmutant, der var målretning i guanosindeaminasegenet sammenlignet med den vilde type plante. En anden pyrimidinkerne, cytidin, blev også kvantitativt påvist i planter, der anvender denne metode, hvilket resulterede i identifikation af et bona fide cytidin deaminase gen4. Baseret på UV-detektoren kan denne metode imidlertid ikke let skelne mellem de nukleotider, der har lignende spektrum og retentionstider, f.eks. Påvisningsgrænsen for HPLC-metoden er relativt høj, derfor anvendes den ofte til måling af højt indhold af nukleotider in vivo, såsom cytidin, uridin og guanosin.
Desuden kan gaskromatografi kombineret med massespektrometri (GC-MS) også anvendes til nukleosidemåling. Nyder godt af det, Hauck et. al. med succes påvist uridin og urinsyre, som er en downstream metabolit af nukleoside kataboliske vej, i frøene af A. thaliana12. GC bruges dog normalt til at adskille flygtige forbindelser, men ikke egnet til de termiske labile stoffer. Derfor er en flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS/MS) sandsynligvis en mere egnet og nøjagtig analyseteknik til in vivo-identifikation, -adskillelse og -kvantificering af nukleotider/nukleotider13,14. Flere tidligere undersøgelser rapporterede , at der kan anvendes en HILIC-kolonne til nukleotider og nukleotiderseparation15,16 , og at der blev anvendt isotopisk mærkede interne standarder for den sammensatte kvantificering17. Begge komponenter er dog relativt dyre, især de kommercielle isotopmærkede standarder. Her rapporterer vi en økonomisk anvendelig LC-MS/MS-tilgang til nukleotider/nukleotider. Denne metode er allerede med succes blevet anvendt til kvantantitation af forskellige nukleotider / nukleotider, herunder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridin, cytidin og pseudouridin1,5,6,18, i planter og Droilasoph. Desuden kan den metode, vi rapporterer her, også anvendes i andre organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organismer indeholder forskellige nukleotider/nukleotider, herunder kanoniske og afvigende organismer. Imidlertid er oprindelsen og metaboliske endepunkter af dem, især modificerede nukleotider, stadig uklare. Desuden er den nuværende forståelse af funktionen og homøostase af nukleotider / nukleotider metabolisme stadig skal udforskes og udvides. For at undersøge dem skal der anvendes en præcis og guldstandardmetode til identifikation og kvantificering af disse metabolitter. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet økonomisk af grundforskningsfondene for de centrale universiteter (KJQN202060), National Natural Science Foundation of China (31900907), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20190528), International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) til M.C., og grundforskningsfondene for de centrale universiteter (LGZD202004) til X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
