Ein syngenes Murinmodell der Endometriose mit natürlich radfahrenden Mäusen
Summary
Viele Nagetiermodelle der Endometriose sind durch technische Komplexität, Reproduzierbarkeit und/oder den Bedarf an immungeschwächten Tieren oder speziellen Reportermäusen begrenzt. Wir präsentieren ein vereinfachtes System der Läsionsinduktion mit jeder experimentellen Maus mit einem unabhängig überprüfbaren, objektiven Scoring-System und ohne Notwendigkeit für Ovariektomie oder Überlebensoperation.
Abstract
Endometriose ist eine der Hauptursachen für Beckenschmerzen und Unfruchtbarkeit. Es wird durch das Vorhandensein von Endometriumgewebe an extrauterinen Stellen definiert. Die Entwicklung neuartiger Therapien und diagnoseträchtischer Instrumente für Endometriose war zum Teil aufgrund von Herausforderungen bei der Untersuchung der Krankheit begrenzt. Außerhalb von Primaten menstruieren nur wenige Säugetiere, und keines entwickelt eine spontane Endometriose. Nagetiermodelle sind beliebt, erfordern jedoch eine künstliche Induktion der Endometriose, wobei viele entweder immungeschwächte Mäuse oder chirurgisch induzierte Erkrankungen verwenden. In jüngster Zeit wurde Modellen mit intraperitonealer Injektion mehr Aufmerksamkeit geschenkt. Wir präsentieren ein murines Modell der Endometriose, das mehrere Merkmale bestehender Endometriosemodelle in ein neuartiges, vereinfachtes System integriert, das auf mikroskopischer Quantifizierung anstelle einer subjektiven Einstufung beruht. In diesem Modell führen wir eine hormonelle Stimulation von Spendermäusen, eine intraperitoneale Injektion, eine systematische Bauchuntersuchung und Gewebeentnahme sowie eine histologische Quantifizierung durch, die jederzeit nach der Nekropsie durchgeführt und verifiziert werden kann. Dieses Modell erfordert nur minimale Ressourcen und Schulungen; erfordert keine Expertise von Labortechnikern in der Mausüberlebenschirurgie oder in der Identifizierung von groben endometriotischen Läsionen; kann bei immungeschwächten, immunkompetenten und/oder mutierten Mäusen angewendet werden; und erzeugt zuverlässig endometriotische Läsionen, die histologisch mit der menschlichen endometriotischen Erkrankung übereinstimmen.
Introduction
Endometriose ist eine rätselhafte Erkrankung des weiblichen Fortpflanzungstraktes mit erheblichen finanziellen und gesundheitlichen Belastungen für Frauen1,2. Die Ätiologie der Endometriose ist nicht vollständig verstanden, und es wurden mehrere Erklärungen vorgeschlagen, darunter coelomische Metaplasie, embryonale Müllersche Reste, Rekrutierung von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen und retrograde Menstruation3. Während mehrere Aspekte dieser vorgeschlagenen Mechanismen beteiligt sein können und keine einzige Erklärung für alle Formen der Krankheit verantwortlich sein kann, ist das führende Modell der Endometriose-Pathogenese die retrograde Menstruation. Retrograde Menstruation ist die Passage von Menstruationsabfluss durch die Eileiter und in die Peritonealhöhle; Es wird geschätzt, dass 90% der menstruierenden Frauen regelmäßig einer retrograden Menstruationunterzogen werden 4,5. Angesichts dieses alltäglichen Phänomens der retrograden Menstruation ist unklar, warum sich Endometriose nur bei einer Untergruppe von Frauen entwickelt5. Um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu verstehen, sind direkte Studien am Menschen nicht durchführbar und Tierversuche sind gerechtfertigt.
Endometriose ist eine Herausforderung sowohl zu behandeln als auch zu untersuchen. Die Prävalenz der Krankheit ist nicht bekannt, wird aber auf 10% geschätzt1. Während einige fortgeschrittene Arten von Endometriose durch nichtinvasive Bildgebung genau identifiziert werden können, wird eine endgültige Diagnose nur durch histopathologische Analyse von chirurgisch erhaltenen Biopsieproben erreicht; Läsionen, die visuell krank zu sein scheinen, können in der Tat Fibrose oder Narbenbildung aus anderen Ursachen sein6. Schwere und Ausmaß der Erkrankung korrelieren nicht mit der Symptomatik7.
Endometrioseläsionen bestehen aus heterogenen Zelltypen und Populationen, die auf komplexe Weise innerhalb der Mikroumgebung interagieren, was die Nützlichkeit zellulärer Modelle einschränkt8,9. In-vivo-Modelle existieren, aber diese haben inhärente Herausforderungen und Einschränkungen10,11,12. Primatenmodelle sind ideal, aber oft nicht realisierbar13,14,15. Nur wenige Nicht-Primaten-Säugetiere menstruieren und entwickeln spontan Endometriose16. Nagetiermodelle der Endometriose existieren, aber jedes hat Einschränkungen17. Viele dieser Modelle erfordern eine Überlebensoperation, um Endometriumgewebe in die Spenderempfängerwand oder den Darm zu nähen oder zu implantieren, was die technische Komplexität, die Notwendigkeit einer Anästhesie und die Störfaktoren der Operation selbst erhöht18,19,20. Darüber hinaus erfordern viele Modelle Ovariektomie und Östrogen-Supplementierung; Während die Läsionsausbeute erhöht wird, erhöht dies Zeit, Kosten und zusätzliche Überlebensoperationen. Intraperitoneale (IP) Injektionsmodelle erfordern keine Anästhesie oder Überlebensoperation, und diese Modelle simulieren logischerweise eine retrograde Menstruation besser als die Nähmodelle21,22,23. Die meisten IP-Modelle unterliegen jedoch einer größeren Variabilität der Läsionsstelle aufgrund der zufälligen Verteilung von Endometriumfragmenten nach der Injektion und damit einer stärkeren Verzerrung bei der Identifizierung und Messung von Läsionen.
Hier präsentieren wir ein murines Modell der Endometriose, das mehrere Merkmale bestehender Endometriosemodelle in ein neuartiges, vereinfachtes und effizientes System integriert, das auf mikroskopischer Quantifizierung anstelle einer subjektiven Einstufung beruht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Studie zeigt, dass Endometriose bei Mäusen zuverlässig induziert werden kann, ohne dass eine Ovariektomie und / oder überlebenschirurgisch erforderlich ist, und dass ektopische Endometriumläsionen mithilfe einer standardisierten Untersuchung des Abdomens und einer histologischen Analyse identifiziert und quantifiziert werden können.
Viele murine Studien zur Endometriose verwenden chirurgi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Reizes-Labors für ihre kritische Überprüfung und Einsichten während der Vorbereitung des Manuskripts sowie den Bild- und Histologie-Kernen am Lerner Research Institute für ihre Unterstützung bei der Datenerhebung und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde durch eine interne Zuschussfinanzierung durch das Research Program Committee der Cleveland Clinic und durch ein externes Stipendium durch die Society for Reproductive Investigation und Bayer unterstützt. Die Forschung im Reizes Laboratory wird auch durch VeloSano Bike to Cure, Center of Research Excellence in Gynecologic Cancer, und durch den Laura J. Fogarty Endowed Chair for Uterine Cancer Research finanziert. Die Cleveland Clinic besitzt die Copyright-Genehmigung für Abbildung 1 und Abbildung 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A. Endometriosis. England Journal of Medicine. 382 (13), 1244-1256 (2020).
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C. Clinical practice. Endometriosis. New England Journal of Medicine. 362 (25), 2389-2398 (2010).
- D’Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R. Clinical management of endometriosis. Obstetrics and Gynecology. 131 (3), 557-571 (2018).
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al. Endometriosis. Endocrine Reviews. 40 (4), 1048-1079 (2019).
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women’s Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
