Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural
Summary
Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.
Abstract
La endometriosis es una de las principales causas de dolor pélvico e infertilidad. Se define por la presencia de tejido endometrial en localizaciones extrauterinas. El desarrollo de nuevas terapias y herramientas de diagnóstico para la endometriosis ha sido limitado debido en parte a los desafíos en el estudio de la enfermedad. Fuera de los primates, pocos mamíferos menstrúan y ninguno desarrolla endometriosis espontánea. Los modelos de roedores son populares, pero requieren la inducción artificial de la endometriosis, y muchos utilizan ratones inmunocomprometidos o enfermedades inducidas quirúrgicamente. Recientemente, se ha prestado más atención a los modelos que involucran la inyección intraperitoneal. Presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso y simplificado que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva. En este modelo, realizamos estimulación hormonal de ratones donantes, inyección intraperitoneal, estudio abdominal sistemático y recolección de tejidos, y cuantificación histológica que se puede realizar y verificar en cualquier momento después de la necropsia. Este modelo requiere recursos y capacitación mínimos; no requiere experiencia de técnicos de laboratorio en cirugía de supervivencia murina o en la identificación de lesiones endometriósicas macroscópicas; se puede utilizar en ratones inmunocomprometidos, inmunocompetentes y/o mutantes; y crea de manera confiable lesiones endometriósticas que son histológicamente consistentes con la enfermedad endometrióstica humana.
Introduction
La endometriosis es una enfermedad enigmática del tracto reproductivo femenino con importantes cargas financieras y de salud para las mujeres1,2. La etiología de la endometriosis no se comprende completamente, y se han propuesto múltiples explicaciones que incluyen metaplasia celómica, restos müllerianos embrionarios, reclutamiento de células progenitoras derivadas de la médula ósea y menstruación retrógrada3. Si bien múltiples aspectos de estos mecanismos propuestos pueden estar involucrados, y ninguna explicación única puede explicar todas las formas de la enfermedad, el modelo principal de patogénesis de la endometriosis es la menstruación retrógrada. La menstruación retrógrada es el paso del efluente menstrual a través de las trompas de Falopio y hacia la cavidad peritoneal; se estima que el 90% de las mujeres que menstrúan regularmente se someten a la menstruación retrógrada4,5. Dado este fenómeno común de la menstruación retrógrada, no está claro por qué la endometriosis se desarrolla solo en un subconjunto de mujeres5. Para comprender mejor la etiología de esta enfermedad, los estudios directos en humanos no son factibles y se justifican los estudios en animales.
La endometriosis es un reto tanto para tratar como para estudiar. La prevalencia de la enfermedad no se conoce, pero se estima que es del 10%1. Si bien algunos tipos avanzados de endometriosis pueden identificarse con precisión a través de imágenes no invasivas, un diagnóstico definitivo solo se logra a través del análisis histopatológico de muestras de biopsia obtenidas quirúrgicamente; lesiones que visualmente parecen estar enfermas, de hecho pueden ser fibrosis o cicatrices por otras causas6. La gravedad y la extensión de la enfermedad no se correlacionan con la sintomatología7.
Las lesiones de endometriosis consisten en tipos celulares heterogéneos y poblaciones que interactúan de manera compleja dentro del microambiente, por lo tanto, limitando la utilidad de los modelos celulares8,9. Los modelos in vivo existen, pero estos tienen desafíos y limitaciones inherentes10,11,12. Los modelos de primates son ideales, pero a menudo no son factibles13,14,15. Pocos mamíferos no primates menstrúan y desarrollan endometriosis espontáneamente16. Existen modelos de endometriosis en roedores, pero cada uno tiene limitaciones17. Muchos de estos modelos requieren cirugía de supervivencia para suturar o implantar tejido endometrial en la pared receptora donante o en el intestino, agregando complejidad técnica, necesidad de anestesia y factores inmunes confusos de la cirugía en sí18,19,20. Además, muchos modelos requieren ovariectomía y suplementos de estrógeno; al tiempo que aumenta el rendimiento de la lesión, esto agrega tiempo, gastos y cirugía de supervivencia adicional. Los modelos de inyección intraperitoneal (IP) no requieren anestesia ni cirugía de supervivencia, y estos modelos lógicamente simulan la menstruación retrógrada mejor que los modelos de sutura21,22,23. La mayoría de los modelos IP, sin embargo, están sujetos a una mayor variabilidad en la ubicación de la lesión debido a la dispersión aleatoria de fragmentos endometriales después de la inyección y, por lo tanto, a un mayor sesgo en la identificación y medición de la lesión.
Aquí presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso, simplificado y eficiente que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro estudio demuestra que la endometriosis se puede inducir de manera confiable en ratones sin requerir el uso de ovariectomía y / o cirugía de supervivencia, y que las lesiones endometriales ectópicas se pueden identificar y cuantificar utilizando una encuesta estandarizada del abdomen y el análisis histológico.
Muchos estudios murinos de endometriosis utilizan endometriosis inducida quirú…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Reizes por su revisión crítica y conocimientos durante la preparación del manuscrito, así como a los núcleos de Imágenes e Histología del Instituto de Investigación Lerner por su asistencia en la recopilación y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado a través de una subvención interna financiada a través del Comité del Programa de Investigación en la Clínica Cleveland y por una subvención externa a través de la Sociedad para la Investigación Reproductiva y Bayer. La investigación en el Laboratorio Reizes también se financia a través de VeloSano Bike to Cure, Centro de Excelencia en Investigación en Cáncer Ginecológico, y a través de la Cátedra Laura J. Fogarty para la Investigación del Cáncer Uterino. Cleveland Clinic posee el permiso de derechos de autor para la Figura 1 y la Figura 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
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