Isolering af murin atriale og ventrikulære myocytter af høj kvalitet til samtidige målinger afCa2+ transienter og L-type calciumstrøm
Summary
Musmodeller gør det muligt at studere nøglemekanismer for arytmogenese. Til dette formål er kardiomyocytter af høj kvalitet nødvendige for at udføre patch-clamp-målinger. Her beskrives en metode til isolering af murine atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion, som muliggør samtidige målinger af calciumtransienter og L-type calciumstrøm.
Abstract
Musemodeller spiller en afgørende rolle i arytmiforskning og gør det muligt at studere nøglemekanismer for arytmogenese, herunder ændret ionkanalfunktion og calciumhåndtering. Til dette formål er atriale eller ventrikulære kardiomyocytter af høj kvalitet nødvendige for at udføre patch-clamp-målinger eller for at undersøge calciumhåndteringsabnormiteter. Det begrænsede udbytte af kardiomyocytter af høj kvalitet opnået ved nuværende isolationsprotokoller tillader imidlertid ikke begge målinger i samme mus. Denne artikel beskriver en metode til at isolere højkvalitets murin atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion til efterfølgende samtidige målinger af calciumtransienter og L-type calciumstrøm fra et dyr. Mushjerter opnås, og aorta kanyleres hurtigt for at fjerne blod. Hjerter perfuseres derefter først med en calciumfri opløsning (37 °C) for at dissociere vævet i niveauet af interkalerede skiver og derefter med en enzymopløsning indeholdende lidt calcium for at forstyrre ekstracellulær matrix (37 °C). Det fordøjede hjerte dissekeres efterfølgende i atria og ventrikler. Vævsprøver hakkes i små stykker og opløses ved omhyggelig pipettering op og ned. Den enzymatiske fordøjelse stoppes, og cellerne genindføres trinvist til fysiologiske calciumkoncentrationer. Efter belastning med en fluorescerende Ca2+-indikator fremstilles isolerede kardiomyocytter til samtidig måling af calciumstrømme og transienter. Derudover diskuteres isolationsfaldgruber, og patch-clamp-protokoller og repræsentative spor af L-type calciumstrømme med samtidige calciumtransiente målinger i atriale og ventrikulære murine myocytter isoleret som beskrevet ovenfor tilvejebringes.
Introduction
Hjertearytmier er almindelige og en af de nuværende store sundhedsudfordringer, da de påvirker millioner af mennesker verden over. Arytmier er forbundet med høj sygelighed og dødelighed 1,2 og repræsenterer den underliggende årsag til størstedelen af pludselige hjertedødsfald3. Opdaterede behandlingsmuligheder har forbedret patientens overlevelse, men er stadig hovedsageligt symptomatiske behandlinger snarere end at målrette de underliggende mekanismer. Disse behandlinger har således begrænset effekt og kan ofte forårsage alvorlige bivirkninger 4,5,6. En forbedring af de nuværende behandlingsmuligheder kræver indsigt i den underliggende patofysiologi, hvilket skaber behov for egnede modeller at studere. Små dyremodeller – og specifikt musemodeller – spiller en afgørende rolle i arytmiforskning, da de giver mulighed for at studere nøglemekanismer for arytmogenese, for eksempel den genetiske indvirkning på cellulær elektrofysiologi, ionkanalfunktion eller calciumhåndtering 7,8.
Til dette formål kræves isolerede atriale og ventrikulære kardiomyocytter af tilstrækkelig mængde og levedygtighed. Et bredt spektrum af forskellige isolationsmetoder til opnåelse af atriale og ventrikulære myocytter er tidligere blevet beskrevet 9,10,11,12,13, og nogle grupper har præsenteret data fra samtidige målinger af L-type strøm og calciumstrøm induceret calciumtransienter fra enten atriel 14 eller ventrikulær 15 murin kardiomyocytter. Men så vidt vi ved, er der ingen tilgængelige data om atriale såvel som ventrikulære målinger fra et dyr. Forskere fokuserer på en bred vifte af emner lige fra elektrofysiologi til proteomics, funktionelle undersøgelser som cellekontraktilitet eller proteininteraktioner, mitokondriefunktion eller genetik – alle med behov for isolerede kardiomyocytter. Mange af de offentliggjorte protokoller er således ikke specifikt udviklet til patch clamp studier, hvilket fører til begrænsede udbytter og utilstrækkelig cellekvalitet til patch clamp studies. Således kan samtidige patch clamp og calcium transiente målinger af atriale og ventrikulære celler isoleret fra et dyr ikke udføres med etablerede protokoller.
Isolering af murin – især atriale – myocytter til patch clamp eksperimenter forbliver udfordrende. Denne artikel giver en enkel og hurtig metode til isolering af højkvalitets murin atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion, som efterfølgende muliggør samtidige målinger af både nettomembranstrøm og strøminducerede calciumtransienter fra et dyr. Denne artikel uddyber en protokol til isolering af atriale og ventrikulære myocytter afledt af vildtypemus og mus, der bærer genetiske mutationer. Denne protokol kan bruges til både han- og hunmus. Myocytisolationen, billederne og de repræsentative resultater, der er beskrevet nedenfor, blev opnået fra vildtype C57Bl/6-mus i en alder af 6 (± 1) måneder. Ikke desto mindre er denne protokol med succes blevet brugt til mus i forskellige aldre fra 2 til 24 måneder med forskellige genotyper. Figur 1 viser isolationsopsætningen og et nærbillede af et kanyleret hjerte under enzymperfusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel giver en nem og funktionel måde at opnå atriale og ventrikulære myocytter af høj kvalitet fra den samme mus til patch-clamp-undersøgelser med samtidige calciumtransiente optagelser. Kvaliteten af de opnåede data afhænger stærkt af kvaliteten af celleisoleringen. Som nævnt ovenfor er mange metoder til isolering af murine kardiomyocytter tidligere beskrevet 9,10,11,12. De i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af German Research Foundation (DFG; Klinikerforskerprogram i vaskulær medicin (PRIME), MA 2186/14-1 til P. Tomsits og D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 og SFB1002 projekt A13 til N. Voigt), German Research Foundation under Tysklands Excellence Strategy (EXC 2067/1- 390729940 til N. Voigt), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss og N. Voigt; 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss), Heinrich-og-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss) og Else-Kröner-Fresenius Foundation (EKFS 2016_A20 til N. Voigt). Bidragyderne havde ingen rolle i udarbejdelsen af manuskripter.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
