描述了一种多功能的微流体装置,它利用反扩散方法使酶结晶,通过浸泡在晶体中引入基材,以及酶的3D结构测定:通过在室温下对芯片内部晶体进行连续分析,使酶结晶复杂。
在X射线分析之前,制备井喷晶体及其处理是生物晶体学研究的两个关键步骤。我们描述了一种多功能的微流体芯片,它通过有效的反扩散方法使晶体得以生产。微流体通道提供的无对流环境是晶体生长的理想之选,有助于将基板扩散到晶体酶的活性部位。在这里,我们应用这种方法的CCA添加酶的精神病细菌 普莱诺克氏杆菌 在介绍的例子。经过结晶和基底扩散/浸泡后,通过连续晶体学和芯片内多个晶体的分析,在室温下确定了酶的晶体结构:基底复合物。整个过程保留了样品的真正衍射特性,因为它不需要水晶处理。
晶体学是破译生物大分子3D结构的方法。后者对于了解酶如何选择和处理其基质非常重要。晶体结构的确定需要目标大分子的结晶和晶体的调理,以进行X射线衍射1的分析。晶体制备和处理都是关键但微妙的步骤,可以影响晶体质量和衍射特性,从而影响由此产生的 3D 结构的分辨率(即精度)。为了方便制备高品质的晶体,并消除不必要的处理,以保持其衍射性能,我们设计了一个用户友好和多功能的微流体设备称为ChipX2,3,4。
在本文中,我们将演示如何使用传统的实验室材料将蛋白质溶液加载到 ChipX 通道中,通过反扩散来制备晶体。由于结晶剂5、6的扩散产生的浓度梯度,这种结晶方法可有效筛选含有酶溶液的微流道沿线的超饱和度和潜在核化条件。
芯片设置简单,仅使用标准实验室管道,不需要任何昂贵的设备。当晶体在 ChipX 中生长时,酶的配体可以通过扩散引入。然后,利用同步加速器 X 射线源在芯片通道中包含的一系列晶体的室温下收集衍射数据。这里描述的结构研究导致确定一个tRNA成熟酶的结构在其apo形式和复杂与模拟其CTP基板引入浸泡。这种称为CCA添加酶的蛋白质在tRNA的3端聚合CCA三核苷酸尾部。通过串行晶体学获得的两个3D图像的比较揭示了与配体结合相关的局部构象变化,这些变化在比低温晶体学中使用的条件下更具生理性。本视频中描述的协议通常适用于任何生物分子,无论是蛋白质、核酸还是多成分复合物。
目前生物晶体学中的协议包括使用蒸汽扩散或第13、14批等方法制备晶体,并在低温条件下在氮气喷射中进行扩散分析之前,将其转移到微循环中进行低温冷却15、16。 相比之下,在 ChipX3中不可能直接进行晶体低温冷却,也无法从其微流体通道中提取晶体,这可被视为此设置的局限性。然而,本文中描述的协议为在室温下(即在更生理条件下)确定晶体结构提供了一个完全集成的管道。尽管室温下的数据收集会导致辐射损伤增加19,但这种效果通过快速数据采集时间(每个晶体上最多收集 60° 旋转)和合并多个部分数据集来抵消。ChipX 的设计和材料都进行了优化,以减少背景散射和衍射信号衰减3,数据收集可以在晶体上进行,其尺寸相当于通道大小的一半 (40μm)4。
综上所述,协议的主要优点如下。这些晶体是在无对流环境中(微流体通道)生产的,非常有利于优质晶体的生长。ChipX中实施的反扩散方法在筛选超饱和景观方面非常有效:晶体扩散到芯片通道中,形成浓度和超饱和波,有助于确定适当的核化和生长条件5。晶体从不直接处理,而是在芯片内部进行原位分析,从而保留其真正的衍射特性(即不通过物理相互作用或低温吸附改变晶体马赛克)20。衍射分析对分布在低剂量暴露芯片通道上的一系列晶体进行,以最大限度地减少辐射损伤,并通过合并该系列的部分数据来组装完整的数据集。ChipX 的标准足迹和简单的设计将允许将来使用同步加速器或 XFEL 设施实现 现场 数据收集的完全自动化。协议的所有步骤均在 ChipX 中执行。从实验者的角度来看,芯片设置简单易用的标准移液器执行,不需要任何额外的设备。样品入口的树状通道连接可最大限度地减少系统中的死体积,这在处理难以纯化或仅限数量有限的样品时非常重要。
总之,ChipX 中实施的片上实验室方法通过反扩散和晶体结构测定简化并有效地小型化结晶过程,从而允许在单个设备中从样品到其 3D 结构。它广泛适用,为室温下的常规连续生物晶体扫描研究提供了用户友好、经济高效的解决方案。
The authors have nothing to disclose.
作者承认瑞士光源(瑞士维利根)在光束线 X10SA (PXII) 和 X06DA (PXIII) 上的光束时间分配,亚历山德拉·布卢姆对结构优化的贡献,克拉丽莎·沃斯代尔对画外音的录制,弗朗索瓦·施内尔(斯特拉斯堡大学)协助视频编辑和 SFX。这项工作得到了斯特拉斯堡大学法国国家科学研究中心(CNRS)的支持, LabEx财团”NetRNA”(ANR-10-LABX-0036_NETRNA),斯特拉斯堡大学卓越计划(IdEx)的博士基金,在法国国家项目”Avenir投资”的框架下,由法国-德国大学(UFA-DFH)向K.R.提供博士学位,授予第1名。CT-30-19),德国福松斯格梅因沙夫特(授予号)莫 634/10-1)。作者受益于普罗科佩·休伯特·库里安合作项目(法国外交部和德国外交部长阿卡德米舍尔·奥斯塔施蒂安斯特)。
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |