En alsidig mikrofluidisk enhed beskrives, der muliggør krystallisering af et enzym ved hjælp af modspredningsmetoden, indførelsen af et substrat i krystallerne ved iblødsætning og 3D-strukturbestemmelsen af enzymet:substratkomplekset ved en seriel analyse af krystaller inde i chippen ved stuetemperatur.
Forberedelsen af godt spredende krystaller og deres håndtering før deres røntgenanalyse er to kritiske trin i biokrystallografiske undersøgelser. Vi beskriver en alsidig mikrofluidisk chip, der muliggør produktion af krystaller ved hjælp af den effektive metode til modspredning. Det konvektionsfrie miljø, der leveres af de mikrofluidiske kanaler, er ideelt til krystalvækst og nyttigt til at sprede et substrat i det krystallinske enzyms aktive sted. Her anvendte vi denne tilgang til det CCA-tilsatte enzym i den psykiske bakterie Planococcus halocryophilus i det præsenterede eksempel. Efter krystallisering og substratdiffusion/iblødsætning blev krystalstrukturen i enzymet:substratkomplekset bestemt ved stuetemperatur ved seriel krystallografi og analyse af flere krystaller direkte inde i chippen. Hele proceduren bevarer prøvernes ægte diffraktionsegenskaber, fordi det ikke kræver krystalhåndtering.
Krystallografi er en metode til at dechifrere 3D-arkitekturen i biologiske makromolekyler. Sidstnævnte er vigtigt at forstå, hvordan et enzym vælger og behandler dets substrater. Bestemmelsen af en krystalstruktur kræver krystallisering af målmakromolekylet og konditionering af krystallerne til deres analyse ved røntgendiffraktion1. Både krystalforberedelse og håndtering er afgørende, men delikate trin, der kan påvirke krystalkvaliteten og diffraktionsegenskaberne, og dermed opløsningen (dvs. nøjagtigheden) af den resulterende 3D-struktur. For at lette forberedelsen af krystaller af høj kvalitet og eliminere unødvendig håndtering for at bevare deres diffraktionsegenskaber designede vi en brugervenlig og alsidig mikrofluidisk enhedkaldetChipX 2,3,4.
I denne artikel vil vi demonstrere, hvordan vi indlæser proteinopløsningen i ChipX-kanaler ved hjælp af konventionelt laboratoriemateriale til at forberede krystaller ved moddiffusion. Denne krystalliseringsmetode giver en effektiv screening af overmætning og potentielle nukleationsforhold langs de mikrofluidiske kanaler, der indeholder enzymopløsningen på grund af koncentrationsgradienten genereret ved diffusionen af krystalliseringsmidlet5,6.
Chipopsætningen er enkel, den bruger kun standardlaboratoriepipetter og kræver ikke noget dyrt udstyr. Når krystaller er vokset i ChipX, ligands af enzymet kan indføres ved diffusion. Diffraktionsdata indsamles derefter ved stuetemperatur på en række krystaller indeholdt i chippens kanaler ved hjælp af en synkrotron røntgenkilde. Den strukturundersøgelse, der er beskrevet her, førte til bestemmelse af strukturer af et tRNA-modningsenzym i dets apoform og i kompleks med en analog af dets CTP-substrat indført ved iblødsætning. Dette protein kaldet CCA-tilsættende enzym polymeriserer CCA trinucleotidhale i 3 ‘ slutningen af tRNA’er. Sammenligningen af de to 3D-billeder opnået ved seriel krystallografi afslører de lokale konformationsmæssige ændringer relateret til bindingen af liganden under forhold, der er mere fysiologiske end dem, der anvendes i kryo-krystallografi. Den protokol, der er beskrevet i denne video, gælder generelt for ethvert biomolekyle, det være sig et protein, en nukleinsyre eller et multikomponentkompleks.
Nuværende protokoller i biokrystallografi indebærer fremstilling af krystaller ved hjælp af metoder som dampspredning eller batch13,14, og deres overførsel til en mikroloop til kryokøling15,16, før de udfører diffraktionsanalysen i en nitrogenstråle ved kryogene forhold. I modsætning hertil er direkte krystal kryokøling ikke mulig i ChipX3, og krystaller kan ikke udvindes fra deres mikrofluidiske kanal, hvilket kan ses som begrænsninger i denne opsætning. Den protokol, der er beskrevet i artiklen, giver imidlertid en fuldt integreret rørledning til bestemmelse af krystalstrukturer ved stuetemperatur (dvs. under mere fysiologiske forhold). Selv om dataindsamling ved stuetemperatur medfører en stigning i strålingsskader19, opvejes denne effekt af hurtig dataindsamlingstid (der indsamles maksimalt 60° rotation på hver krystal) og ved sammenlægning af flere delvise datasæt. Både ChipX-design og materiale blev optimeret til at reducere baggrundsspredning og diffraktionssignaldæmpning3, og dataindsamling kan udføres på krystaller med dimensioner svarende til halvdelen af kanalernes størrelse (40 μm)4.
Sammenfattende kan det siges, at de vigtigste fordele ved protokollen er følgende: Krystallerne produceres i et konvektionsfrit miljø (mikrofluidiske kanaler), hvilket er meget gunstigt for væksten af krystaller af høj kvalitet. Den modspredningsmetode, der implementeres i ChipX, er meget effektiv til at screene overmætningslandskabet; diffusionen af krystallanter i spånkanalen skaber en koncentrations- og overmætningsbølge, der hjælper med at bestemme passende kerne- og vækstbetingelser5. Krystaller håndteres aldrig direkte, men analyseres in situ, inde i chippen, som bevarer deres ægte diffraktionsegenskaber (dvs. ændrer ikke krystalmosaik ved fysisk interaktion eller cryocooling)20. Diffraktionsanalysen udføres på en række krystaller fordelt langs chipkanalerne med lav dosiseksponering for at minimere strålingsskader, og et komplet datasæt samles ved at fusionere delvise data fra serien. ChipX’s standardfodaftryk og enkle design vil i fremtiden muliggøre en komplet automatisering af in situ-dataindsamling ved hjælp af synkrotron- eller XFEL-faciliteter. Alle trin i protokollen udføres i ChipX. Fra eksperimentatorens synspunkt er chipopsætning enkel og nem at udføre med standardpipetter og kræver ikke ekstra udstyr. Den trælignende kanalforbindelse ved prøveindløbet minimerer døde mængder i systemet, hvilket er vigtigt, når du arbejder med prøver, der er vanskelige at rense, eller som kun er tilgængelige i begrænset mængde.
Afslutningsvis forenkler og effektivt miniaturiserer lab-on-a-chip-tilgangen implementeret i ChipX processen med krystallisering ved at modvirke diffusion og krystalstrukturbestemmelse, hvilket gør det muligt at gå fra prøven til dens 3D-struktur i en enkelt enhed. Det er bredt anvendeligt og tilbyder en brugervenlig, omkostningseffektiv løsning til rutinemæssige serielle biokrystallografiundersøgelser ved stuetemperatur.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender den schweiziske lyskilde (Villigen, Schweiz) for beamtime tildeling til projektet på beamlines X10SA (PXII) og X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm for hendes bidrag til struktur raffinement, Clarissa Worsdale til optagelse af voiceover og François Schnell (Université de Strasbourg) for hans hjælp i videoredigering og SFX. Dette arbejde blev støttet af det franske center National de la Recherche Scientifique (CNRS), Universitetet i Strasbourg, LabEx-konsortiet “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en ph.d.-finansiering til R.dW fra Excellence-initiativet (IdEx) fra Universitetet i Strasbourg inden for rammerne af det franske nationale program “Investissements d’Avenir”, en ph.d.-finansiering til K.R. fra det fransk-tyske universitet (UFA-DFH, giv nr. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud nr. Mo 634/10-1). Forfatterne nød godt af PROCOPE Hubert Curien samarbejdsprogram (det franske udenrigsministerium og Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |