Elektroporationsbaserad genetisk modifiering av primära mänskliga pigmentepitelceller med hjälp av Törnrosa Transposon System

Summary

Vi har utvecklat ett protokoll för att transfektera primära humana pigmentepitelceller genom elektroporering med genen som kodar för pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Framgångsrik transfektion demonstrerades genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA).

Abstract

Vårt allt äldre samhälle leder till en växande förekomst av neurodegenerativa sjukdomar. Hittills är de patologiska mekanismerna otillräckligt förstådda, vilket hindrar upprättandet av definierade behandlingar. Cellbaserade additiva genterapier för ökat uttryck av en skyddande faktor anses vara ett lovande alternativ för att medicinera neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi har utvecklat en metod för stabilt uttryck av den genkodande pigmentepitel-härledda faktorn (PEDF), som karakteriseras som ett neuroprotektivt och antiangiogent protein i nervsystemet, in i genomet hos primära humana pigmentepitelceller (PE) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Primära PE-celler isolerades från mänskliga donatorögon och upprätthölls i odling. Efter att ha nått sammanflödet suspenderades 1 x 10⁴ celler i 11 μl resuspensionsbuffert och kombinerades med 2 μL av en renad lösning innehållande 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposasplasmid och 470 ng PEDF-transposonplasmid. Genetisk modifiering utfördes med ett kapillärelektroporationssystem med användning av följande parametrar: två pulser med en spänning på 1 100 V och en bredd på 20 ms. Transfekterade celler överfördes till odlingsplattor innehållande medium kompletterat med fetalt bovint serum; Antibiotika och antimykotika tillsattes med det första medieutbytet. Framgångsrik transfektion demonstrerades i självständigt utförda experiment. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) visade det ökade uttrycket av PEDF-transgenen. PEDF-sekretionen var signifikant förhöjd och förblev stabil, vilket utvärderades genom immunoblotting och kvantifierades med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). SB100X-medierad överföring möjliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet hos PE-celler och säkerställde kontinuerlig utsöndring av PEDF, vilket är avgörande för utvecklingen av en cellbaserad genadditionsterapi för att behandla AMD eller andra retinala degenerativa sjukdomar. Dessutom indikerade analys av integrationsprofilen för PEDF-transposonen till mänskliga PE-celler en nästan slumpmässig genomisk fördelning.

Introduction

Hög ålder beskrivs som den största risken för neurodegenerativa sjukdomar. Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen sjukdom som leder till svår synförlust hos patienter äldre än 60 år, tillhör de fyra vanligaste orsakerna till blindhet och synnedsättning¹ och förväntas öka till 288 miljoner människor 2040². Dysfunktioner i retinal pigmentepitel (RPE), ett enda lager av tätt packade celler belägna mellan choriocapillaris och retinala fotoreceptorer, bidrar till patogenesen av AMD. RPE uppfyller flera uppgifter som är väsentliga för en normal retinal funktion³ och utsöndrar en mängd olika tillväxtfaktorer och faktorer som är väsentliga för att upprätthålla den strukturella integriteten hos näthinnan och choriokapillaris, vilket stöder fotoreceptoröverlevnad och ger en grund för cirkulationen och tillförseln av näringsämnen.

I friska ögon är pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) ansvarig för att balansera effekterna av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och skyddar neuroner mot apoptos, förhindrar endotelcellsproliferation och stabiliserar kapillärendotelet. Ett skiftat VEGF-till-PEDF-förhållande är relaterat till okulär neovaskularisering, vilket observerades i djurmodeller ^4,5 samt i prover av patienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grund av AMD och proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den förbättrade VEGF-koncentrationen är målet för den nuvarande standardbehandlingen. Anti-VEGF-läkemedlen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept och senast brolucizumab förbättrar synskärpan hos cirka en tredjedel av CNV-patienterna eller snarare stabiliserar synen i 90% av fallen^11,12,13. De frekventa, ofta månatliga, intravitreala injektionerna medför dock risken för biverkningar¹⁴, försämrar patienternas efterlevnad och utgör en betydande ekonomisk börda för hälso- och sjukvårdssystemen¹⁵. Dessutom svarar en viss andel av patienterna (2%-20%) inte eller reagerar bara dåligt på anti-VEGF-behandlingen^16,17,18,19. Dessa negativa samtidiga kräver utveckling av alternativa behandlingar, t.ex. intraokulära implantat, cell- och/eller genterapeutiska metoder.

Genterapi har utvecklats som lovande behandling för ärftliga och icke-ärftliga sjukdomar och avser att återställa icke-funktionella gensekvenser eller undertrycka felaktiga sådana. För polygena sjukdomar, där identifiering och ersättning av orsaksfaktorerna knappast är möjlig, syftar strategierna till kontinuerlig leverans av en skyddande faktor. När det gäller AMD har olika additiva terapier utvecklats, såsom det stabila uttrycket av endostatin och angiostatin 20, VEGF-antagonisten lösligt fms-liknande tyrosinkinas-1 (sFLT-1)21,22, komplementet reglerande proteinkluster av differentiering 59 (CD59)²³ eller PEDF ^24,25 . Ögat, och särskilt näthinnan, är ett utmärkt mål för en genbaserad medicinering på grund av den slutna strukturen, god tillgänglighet, liten storlek och immunprivilegium, vilket möjliggör en lokal leverans av låga terapeutiska doser och gör transplantationer mindre mottagliga för avstötning. Dessutom möjliggör ögat icke-invasiv övervakning, och näthinnan kan undersökas med olika bildtekniker.

Virala vektorer är, på grund av deras höga transduktionseffektivitet, det viktigaste fordonet för att leverera terapeutiska gener till målceller. Beroende på vilken virusvektor som används har dock olika biverkningar beskrivits, såsom immun- och inflammatoriska svar²⁶, mutagena och onkogena effekter ^27,28 eller spridning i andra vävnader²⁹. Praktiska begränsningar inkluderar en begränsad förpackningsstorlek³⁰ samt svårigheter och kostnader i samband med produktionen av partier^31,32 av klinisk kvalitet. Dessa nackdelar har främjat den fortsatta utvecklingen av icke-virala, plasmidbaserade vektorer som överförs via lipo-/polyplexer, ultraljud eller elektroporering. Emellertid främjas inte genomisk integration av transgenen i värdgenomet vanligtvis inte med plasmidvektorer, vilket resulterar i ett övergående uttryck.

Transposoner är naturligt förekommande DNA-fragment som ändrar sin position i genomet, en egenskap som har antagits för genterapi. På grund av en aktiv integrationsmekanism möjliggör transposonbaserade vektorsystem ett kontinuerligt och konstant uttryck av den införda transgenen. Törnrosa (SB) transposon, rekonstituerad från en gammal Tc1/mariner-typ transposon som hittades i fisk³³ och förbättrades ytterligare genom molekylär evolution vilket resulterade i den hyperaktiva varianten SB100X³⁴, möjliggjorde effektiv transponering i olika primära celler och användes för fenotypisk korrigering i olika sjukdomsmodeller³⁵. För närvarande har 13 kliniska prövningar inletts med hjälp av SB-transposonsystemet. SB100X-transposonsystemet består av två komponenter: transposonen, som består av genen av intresse flankerad av terminala inverterade upprepningar (TIR), och transposaset, som mobiliserar transposonen. Efter plasmid-DNA-leverans till cellerna binder transposaset TIR: erna och katalyserar excisionen och integrationen av transposonen i cellens genom.

Vi har utvecklat en icke-viral cellbaserad additiv terapi för behandling av neovaskulär AMD. Tillvägagångssättet omfattar elektroporationsbaserad införande av PEDF-genen i primära pigmentepitelceller (PE) med hjälp av SB100X-transposonsystemet ^36,37,38. Den genetiska informationen om transposas och PEDF tillhandahålls på separata plasmider, vilket möjliggör justering av det ideala SB100X-till-PEDF-transposonförhållandet. Elektroporering utförs med hjälp av ett pipettbaserat kapillärtransfektionssystem som kännetecknas av en maximerad gapstorlek mellan elektroderna samtidigt som deras ytarea minimeras. Enheten visade sig uppnå utmärkta transfektionshastigheter i ett brett spektrum av däggdjursceller 39,40,41. Den lilla elektrodytan ger ett jämnt elektriskt fält och minskar de olika biverkningarna av elektrolys⁴².

Den anti-angiogena funktionaliteten hos PEDF som utsöndras av transfekterade pigmentepitelceller visades i olika in vitro-experiment som analyserade spridning, migration och apoptos av humana navelvenendotelceller⁴³. Dessutom visade transplantation av PEDF-transfekterade celler i en kaninmodell av hornhinnans neovaskularisering⁴⁴ samt en råttmodell av CNV^43,45,46 nedgång av neovaskularisering.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för stabil insättning av PEDF-genen i primära humana RPE-celler via SB100X-transposonsystemet med hjälp av ett kapillärtransfektionssystem. De transfekterade cellerna hölls i odling i 21 dagar och analyserades därefter med avseende på PEDF-genuttryck genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) och i termer av PEDF-proteinsekretion genom immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA, figur 1).

Protocol

Mänskliga donatorögon erhölls från Aachen Cornea Bank vid avdelningen för oftalmologi (Universitetssjukhuset RWTH Aachen) efter att ha fått informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationens protokoll. Förfaranden för insamling och användning av humanprover har godkänts av den institutionella etiska kommittén. 1. Isolering av primära humana RPE-celler Lägg ut sterila skyddskläder och handskar. Placera ett sterilt draperi under ett laminärt flöde. P…

Representative Results

Odling och elektroporering av primära humana RPE-cellerVi har visat att sådd av ett tillräckligt antal primära RPE-celler av animaliskt ursprung möjliggör odling och tillväxt till ett integrerat monolager av pigmenterade, sexkantigt formade celler36,37,48. Deras förmåga att bilda täta korsningar, att uppvisa fagocytisk aktivitet och att uttrycka specifika markörgen…

Discussion

I vårt projekt strävar vi efter icke-viral produktion av genetiskt modifierade primära humana RPE-celler som kontinuerligt överuttrycker och utsöndrar en effektiv faktor för att kunna använda de transfekterade cellerna som långsiktig terapeutisk för etablering och underhåll av en skyddande miljö. Vi har etablerat introduktionen av genen som kodar för PEDF, ett allestädes närvarande uttryckt multifunktionellt protein med anti-angiogena och neuroprotektiva funktioner. Protokollet som beskrivs här kan använd…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054