태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양
Summary
우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.
Abstract
복잡한 질병에서 치료 전략의 효능을 평가하기 위한 약물 선별 기술 개발의 주요 장애물은 생체 내 단순화와 생체 내 환경에서 복잡한 복합체를 재현하는 것 사이의 균형을 맞추는 것이며, 모든 선별 전략에 의해 공유되는 주요 목표와 함께 생체 변환에 대한 예측이 매우 중요합니다.
탈근성 질환 분야에서, 약물 선별 전략의 대부분은 신생아 동물의 고립 된 1 차 성 올리고 드로시테 전구체 (OpC)의 불멸의 세포주 또는 순수한 배양에 기초하여 연령과 관련된 차이의 부족과 실제 병리학 적 상태 또는 복잡성으로 인해 강한 편견으로 이어진다.
여기서 는 신경 줄기 세포 (NSC)에서 파생 된 OpC의 생리적 분화 / 성숙을 모델링하기위한 체외 시스템의 설정을 보여 주며, 탈근 질환의 전형적인 병리학 적 조건을 모방하기 위해 쉽게 조작됩니다. 또한, 이 방법은 태아와 성인용 두뇌로부터의 격리를 포함하며, 성상세포도 포함하는 자발적인 공동 배양에서 OPC에서 성숙한 올리고드로키테스(OLs)로 동적으로 차별화되는 시스템을 제공합니다. 이 모델은 생리학적으로 갑상선 호르몬 매개 myelination 및 myelin 수리 과정과 유사하여 질병 메커니즘을 모델링하는 병리학적 간섭을 첨가할 수 있습니다. 우리는 탈수성 질환 (즉, 저산소증 / 허혈및 염증)의 두 가지 주요 구성 요소를 모방하는 방법을 보여줍니다, 발달 골수화및 성인 myelin 수리에 미치는 영향을 재현하고 전체 계정에 시스템의 모든 세포 구성 요소를 복용, OpC를 차별화에 초점을 맞추고있는 동안.
이 자발적인 혼합 모델은 세포 기반고함량 선별 기술과 결합되어 탈량에 관련된 병리학 적 과정을 퇴치하고 재myelination을 유도하기위한 치료 전략을위한 강력하고 신뢰할 수있는 약물 선별 시스템을 개발 할 수 있습니다.
Introduction
중추신경계(CNS)에서 미엘린 형성 세포(oligodendrocytes, OLs) 및 그들의 전구체(oligodendrocyte 전구체 세포, OpC)는 발달 근생, peri 및 산후 기간 동안 발생하는 과정, 그리고성년1에서골린 회전율 및 수리(재제동)에 대한 책임이 있다. 이 세포는 고도로 전문화되어 해부학적으로 그리고 다른 모든 신경교 및 신경 성분과 기능적으로 상호 작용하여 CNS 구조 및 기능의 근본적인 부분을 만듭니다.
탈제 이벤트는 다른 CNS 부상과 질병2에관여하고, 주로 개발 및 성인기 동안 다인적 메커니즘의 방법으로 OpC와 OLs에 작용합니다. 미분화 전구체는 분화 요인에 의해 구동되며, 주로 갑상선 호르몬(TH)을 구분하여 OPC가 증식을 유도하는 특정 자극에 인식하고 반응하도록 유도하는 동기화된 과정3, 비골암축으로의 이동, 그리고 성숙한 OLs로의 분화로 전환하여 골린 시스4를차례로 개발한다. 이러한 모든 프로세스는 미세하게 제어되며 복잡한 환경에서 발생합니다.
근생, 재생물 및 탈량 이벤트의 복잡한 특성으로 인해, 기본 메커니즘을 연구하고 주요 세포 플레이어에 초점을 맞춘 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 단순화되고 신뢰할 수있는 시험관 내 방법에 대한 큰 필요성이 있다: OPC5.
체외 계통이 신뢰할 수 있도록, 셀룰러 환경의 복잡성, 연령 관련 세포 내재성 차이, 생리적 TH 매개 분화 분화, 병리학 적 메커니즘 및 데이터6의견고성 등 여러 가지 요인을 고려해야합니다. 실제로, 현장에서 충족되지 않은 필요는 고립 된 순수 OPC 문화의 사용을 통해 성공적으로 달성되지 않은 생체 내 상태의 복잡성을 모방한 모델입니다. 또한, 탈밀증 사건의 두 가지 주요 구성 요소, 염증 및 저산소증/허혈 (HI), 직접 간접적으로 APC의 생리적 분화 및 성숙에 영향을 미칠 수있는 다른 세포 구성 요소를 포함, 지나치게 단순화 된 체외 모델에서 공부 할 수없는 측면.
예측이 매우 높은 문화 시스템에서 시작하여 보다 일반적인 과제는 강력하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생산하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 세포 기반고함량 스크리닝(HCS)은 가장 적합한 기술7이며,우선 전체 문화를 자동 워크플로우로 분석하여 대표 분야를 선택하는 편견을 피하고, 둘째는 이미징 기반고함량 데이터8의자동 및 동시 생성을 얻는 것입니다.
주요 필요는 시험관 내 단순화와 생체 모방 복잡성 사이의 최상의 균형을 달성하는 것입니다 감안할 때, 여기서 우리는 태아 전뇌와 성인 하위 심실 영역 (SVZ)에서 분리 된 신경 줄기 세포 (NSC)에서 파생 된 OpC를 얻기위한 매우 재현 가능한 방법을 제시한다. 이 체외 모델은 다능 NSC에서 성숙한/마일리네팅 OL에 이르기까지 전체 OPC 분화 과정을 생리적인 TH 의존적 방식으로 포괄합니다. 결과 배양은 주로 CPC와 성상 세포를 분화하는 자발적인 공동 배양으로 인해 뉴런의 비율이 낮은 동적으로 차별화/maturating 시스템입니다. 이 1 차 배양은 생체 내 환경에서 복합체를 더 잘 모방하고 줄기 세포 파생은 간단한 조작을 통해 원하는 세포 혈통 농축을 얻을 수 있게 합니다.
1차 OpC의 세포주 또는 순수 배양을 이용한 다른 약물 선별 전략과는 달리, 여기서 설명된 방법은 바람직한 세포 유형에 초점을 잃지 않고 복잡한 환경에서 병리학적 간섭 또는 치료 분자의 효과에 대한 연구를 허용한다. 설명된 HCS 워크플로우는 세포 생존가능성 및 계보 사양뿐만 아니라 계보별 세포 사멸 및 형태학적 매개변수에 대한 분석을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
myelination/remyeliination 프로세스및 탈근 이벤트의 복잡한 특성은 예측 시험관 시스템의 개발을 매우 어렵게 만듭니다. 체외 약물 선별 시스템에서 가장 널리 사용되는 것은 주로 인간 세포주 또는 1차 순수 OL 배양이며, 보다 복잡한 공동 배양 또는 organotypic시스템(15)의사용이 증가하고 있다. 이러한 시스템이 높은 콘텐츠 기술과 결합되어 있더라도, 순수한 OL 문화는 스크리닝<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MIUR 국가 기술 클러스터 프로젝트 IRMI (CTN01_00177_888744) 및 지역 에밀리아 로마냐, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020에 의해 지원.
실험 작업을 주최하기위한 IRET 재단에 특별한 감사.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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