胎児および成人神経幹細胞由来オリゴデンドロビテ前駆細胞培養の高含有スクリーニング分化と成熟解析
Summary
成熟したオリゴデンドロサイトに分化する胎児または成体の神経幹細胞に由来するアストロサイトとオリゴデンドロサイト前駆細胞の混合培養の生成と、有害刺激のインビトロモデリングについて述べています。細胞ベースの高含有スクリーニング技術との結合は信頼でき、強い薬物スクリーニングシステムを造る。
Abstract
複雑な疾患における治療戦略の有効性を評価するための薬物スクリーニング技術の開発における主なハードルは、生体内環境における複雑な簡素化と複雑なインビボ環境の再現と、すべてのスクリーニング戦略によって共有される主な目的とのバランスを取り、堅牢で信頼性の高いデータを得ることです。
脱髄疾患の分野では、薬物スクリーニング戦略の大半は、新生児動物からの単離された原発オリゴデンドロサイト前駆細胞(OpCs)の不死化細胞株または純粋な培養物に基づいており、年齢に関連する差異の欠如および実際の病理学的状態または複雑さによる強い偏見をもたらす。
ここでは、脱髄性疾患に典型的な病理的状態を模倣するために容易に操作できる神経幹細胞(NSC)由来のOpPCの生理的分化/成熟をモデル化することを目的としたin vitroシステムの設定を示す。さらに、この方法には胎児および成人の脳からの分離が含まれており、アストロサイトを含む自発的な共培養において、OPCから成熟したオリゴデンドロサイト(OLs)に動的に分化するシステムを与える。このモデルは、甲状腺ホルモン媒介性骨髄化およびミエリン修復プロセスに生理的に似ており、疾患メカニズムをモデル化する病理学的干渉者の追加を可能にする。脱髄性疾患(低酸素/虚血および炎症)の2つの主要成分を模倣する方法を示し、発達髄鞘化および成人ミエリン修復への影響を再現し、システムのすべての細胞成分を全体に考慮しながら、OpPcの区別に焦点を当てています。
この自発的混合モデルは、細胞ベースの高含有スクリーニング技術と相まって、脱髄に関与する病理学的プロセスとの闘いと再髄化を誘発することを目的とした治療戦略のための堅牢で信頼性の高い薬物スクリーニングシステムの開発を可能にする。
Introduction
中枢神経系(CNS)では、ミエリン形成細胞(オリゴデンドロサイト、OLs)およびその前駆体(オリゴデンドロサイト前駆細胞、OPC)が発達性髄鞘形成、出生前後の期間に起こるプロセス、および成人期におけるミエリンの代謝および修復(remyelieli)を担う。これらの細胞は高度に特殊化されており、他のすべてのグリアおよび神経細胞成分と解剖学的かつ機能的に相互作用し、CNSの構造と機能の基本的な部分を占めています。
脱髄事象は、異なるCNS傷害および疾患2に関与し、主に発達中および成人期の両方の多因子メカニズムを用いてOPCおよびOLsに作用する。未分化前駆体は、主に甲状腺ホルモン(TH)の分化因子によって駆動され、OPCが増殖を誘発する特定の刺激を認識して応答し、非髄系軸索への移行、および成熟したOLへの分化を導く同期プロセス3 において、ミエリン鞘4を発症する。これらのプロセスはすべて細かく制御され、複雑な環境で発生します。
髄鞘化、再髄鞘化、脱髄イベントの複雑な性質により、基底のメカニズムを研究し、新しい治療戦略を開発するための簡単で信頼性の高いin vitro方法が非常に必要です。
in vitroシステムが信頼できるように、細胞環境の複雑さ、細胞内の細胞内の違い、生理学的TH媒介分化、病理学的メカニズム、およびデータの堅牢性を考慮する必要があります。実際、現場でのアンメットニーズは、生体内状態の複雑さを模倣するモデルであり、単離された純粋なOPC培養物の使用によって達成されない。また、脱髄事象の2つの主要成分である炎症および低酸素/虚血(HI)は、APCの生理的分化および成熟に間接的に影響を及ぼす可能性のある他の細胞成分を直接関与し、体外モデルでは過度に単純化できない側面である。
高度な予測型の文化システムから始めて、その後のより一般的な課題は、堅牢で信頼性の高いデータの生成です。この文脈において、細胞系高含有スクリーニング(HCS)は最も適した技術7であり、我々の目的は、まず、自動ワークフローで培養全体を分析し、代表分野を選択する偏りを回避し、第2に、イメージングベースの高コンテンツデータ8の自動かつ同時生成を得ることを目的としている。
インビトロ簡略化と生体内模倣の複雑さの間で最良のバランスを達成することが主な必要性であることを考えると、ここでは胎児前脳と成体心室領域(SVZ)から分離された神経幹細胞(NSC)に由来するOPCを得るための非常に再現可能な方法を提示する。このインビトロモデルは、多能性NSCから成熟/髄形成OLまで、生理学的TH依存的な方法で、OPC分化プロセス全体を包含する。結果として生じる培養は、主に分化するOPCとアストロサイトからなる自発的な共培養を生じ、ニューロンの割合が低い、動的に分化/交配するシステムである。この一次培養は、生体内環境における複合体をよりよく模倣し、その幹細胞誘導により、必要な細胞系統の濃縮を得るための単純な操作を可能にする。
細胞株または一次性APCの純粋な培養物を用いた他の薬物スクリーニング戦略とは対照的に、ここで説明する方法は、所望の細胞タイプに焦点を失うことなく、複雑な環境における病理学的干渉または治療分子の効果の研究を可能にする。HCSワークフローは、細胞生存率と系統仕様の分析、ならびに系統特異的細胞死および形態学的パラメータの分析を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
髄鞘化/再髄化プロセスと脱髄事象の複雑な性質により、インビトロシステムの予測開発は非常に困難です。最も広く使用されているインビトロ薬物スクリーニングシステムは、主にヒト細胞株または一次純粋なOL培養物であり、より複雑な共培養またはorganotypicシステム15の使用が増加している。そのようなシステムが高いコンテンツ技術と結合されていても、純粋なOL培養?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MIURナショナルテクノロジークラスタープロジェクトIRMI(CTN01_00177_888744)、リージョンエミリア・ロマーニャ、Mat2Rep、POR-FESR 2014-2020によってサポートされています。
実験的な作品を主催してくれたIRET財団に感謝します。
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
