Høyinnholds screeningdifferensiering og modningsanalyse av fetal og voksen nevral stamcelle-avledet Oligodendrocyte forløpercellekulturer

Summary

Vi beskriver produksjonen av blandede kulturer av astrocytter og oligodendrocyttforløperceller avledet fra føtal eller voksne nevrale stamceller som skiller seg inn i modne oligodendrocytter, og in vitro modellering av skadelige stimuli. Koblingen med en cellebasert screeningteknikk med høyt innhold bygger et pålitelig og robust legemiddelscreeningssystem.

Abstract

Det viktigste hinderet for å utvikle narkotikascreeningsteknikker for å vurdere effekten av terapeutiske strategier i komplekse sykdommer er å finne en balanse mellom in vitro forenkling og gjenskaping av det komplekse in vivo-miljøet, sammen med hovedmålet, delt av alle screeningstrategier, for å oppnå robuste og pålitelige data, svært prediktivt for in vivo-oversettelse.

Innen demyeliniserende sykdommer er flertallet av narkotikascreeningstrategiene basert på udødelighetscellelinjer eller rene kulturer av isolerte primære oligodendrocyttforløperceller (OPCer) fra nyfødte dyr, noe som fører til sterke fordommer på grunn av mangel på aldersrelaterte forskjeller og av enhver reell patologisk tilstand eller kompleksitet.

Her viser vi oppsettet av et in vitro-system som tar sikte på å modellere den fysiologiske differensiering / modning av nevrale stamceller (NSC) -avledede OPCer, lett manipulert for å etterligne patologiske forhold som er typiske for demyeliniserende sykdommer. Videre inkluderer metoden isolasjon fra foster og voksne hjerner, noe som gir et system som dynamisk skiller seg fra OPC til modne oligodendrocytter (OLs) i en spontan samkultur som også inkluderer astrocytter. Denne modellen fysiologisk ligner skjoldbruskhormonmediert myelinering og myelin reparasjonsprosessen, slik at tilsetning av patologiske interferenter hvilke modell sykdomsmekanismer. Vi viser hvordan man etterligner de to hovedkomponentene i demyeliniserende sykdommer (dvs. hypoksi/iskemi og betennelse), gjenskaper deres effekt på utviklingsal myelinering og voksen myelinreparasjon og tar hensyn til alle cellekomponentene i systemet gjennom hele, samtidig som de fokuserer på å differensiere OPCer.

Denne spontane blandede modellen, kombinert med cellebaserte screeningteknologier med høyt innhold, gjør det mulig å utvikle et robust og pålitelig legemiddelscreeningssystem for terapeutiske strategier for å bekjempe de patologiske prosessene som er involvert i demyelinering og å indusere remyelinasjon.

Introduction

I sentralnervesystemet (CNS) er myelindannende celler (oligodendrocytter, OLs) og deres forløpere (oligodendrocyttforløperceller, OPCer) ansvarlige for utviklings myelinasjon, en prosess som oppstår i peri- og postnatalperiodene, og for myelinomsetning og reparasjon (remyelinasjon) i voksen alder¹. Disse cellene er svært spesialiserte, samhandler anatomisk og funksjonelt med alle de andre gliale og nevronale komponentene, noe som gjør dem til en grunnleggende del av CNS struktur og funksjon.

Demyelinerende hendelser er involvert i forskjellige CNS-skader og sykdommer², og virker hovedsakelig på OPCer og OLer ved hjelp av multifaktoriske mekanismer, både under utvikling og voksen alder. De undifferentiated forløperne er drevet av differensieringsfaktorer, hovedsakelig skjoldbruskhormon (TH), i en synkronisert prosess³ som fører opc til å gjenkjenne og svare på spesifikke stimuli som induserer spredning, migrasjon til ikke-myelinert axon og differensiering til modne OLer som igjen utvikler myelinhylsen⁴. Alle disse prosessene er fint kontrollert og forekommer i et komplekst miljø.

På grunn av den komplekse karakteren av myelinasjon, remyelination og demyelination hendelser, er det et stort behov for en forenklet og pålitelig in vitro-metode for å studere de underliggende mekanismene og utvikle nye terapeutiske strategier, med fokus på den viktigste cellulære spilleren: OPC⁵.

For at et in vitro-system skal være pålitelig, må det tas hensyn til en rekke faktorer: kompleksiteten i det cellulære miljøet, aldersrelaterte celleintrinsiske forskjeller, fysiologisk TH-mediert differensiering, patologiske mekanismer og robustheten til dataene⁶. Faktisk er det udekkede behovet i feltet en modell som etterligner kompleksiteten i in vivo-tilstanden, ikke vellykket oppnådd ved bruk av isolerte rene OPC-kulturer. I tillegg involverer de to hovedkomponentene i demyeliniserende hendelser, betennelse og hypoksi/iskemi (HI), direkte andre cellekomponenter som indirekte kan påvirke den fysiologiske differensiering og modning av OPCer, et aspekt som ikke kan studeres i over-forenklede in vitro-modeller.

Fra et svært prediktivt kultursystem er den påfølgende og mer generelle utfordringen produksjon av robuste og pålitelige data. I denne sammenhengen er cellebasert høyinnholdsscreening (HCS) den mest passende teknikken⁷, siden vårt mål er først å analysere hele kulturen i en automatisk arbeidsflyt, unngå skjevheten ved å velge representative felt, og for det andre å oppnå automatisk og samtidig generering av bildebehandlingsbaserte data med høyt innhold⁸.

Gitt at hovedbehovet er å oppnå den beste balansen mellom in vitro forenkling og in vivo-mimicking kompleksitet, her presenterer vi en svært reproduserbar metode for å skaffe OPCer avledet fra nevrale stamceller (NSC) isolert fra fosteret forebrain og den voksne sub-ventrikkelsonen (SVZ). Denne in vitro-modellen omfatter hele OPC-differensieringsprosessen, fra multipotent NSC til moden/myeliniserende OL, på en fysiologisk TH-avhengig måte. Den resulterende kulturen er et dynamisk differensierings-/modningssystem som resulterer i en spontan samkultur som hovedsakelig består av differensiering av OPC og astrocytter, med en lav prosentandel nevroner. Denne primærkulturen etterligner bedre det komplekse in vivo-miljøet, mens stamcelleavledningen gjør det mulig å utføre enkle manipulasjoner for å oppnå ønsket cellelinjeberikelse.

Tvert imot andre narkotikascreeningsstrategier ved hjelp av cellelinjer eller rene kulturer av primære OPCer, tillater metoden beskrevet her studiet av effekten av patologiske interferenter eller terapeutiske molekyler i et komplekst miljø, uten å miste fokus på ønsket celletype. Den beskrevne HCS-arbeidsflyten tillater en analyse av celle levedyktighet og avledningsspesifikasjon, samt avlinjespesifikke celledøds- og morfologiske parametere.

Protocol

Alle dyreprotokoller som er beskrevet her, ble utført i henhold til EUs fellesskapsrådsdirektiver (86/609/EEC) og overholder retningslinjene som er publisert i NIH-veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr. 1. Løsninger og reagenser Forbered standard medium: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1 % P/S); 1x B27; 1x N-2. Forbered neurosphere medium: legg til 10 ng / ml bFGF; 10 ng/ml EGF til standard medium. <li…

Representative Results

Den første fasen av kulturen kan variere i varighet, avhengig av såddtetthet og om sfærene er av foster- eller voksen opprinnelse. Videre viser oligosfærer en redusert befolkningsdobling sammenlignet med nevrosfærer (Figur 1B). Videre er sfærer produksjon fra voksent vev langsommere, og det kan ta 2-3 uker å generere oligosfærer sammenlignet med foster som kan ta 1-2 uker, avhengig av såddtettheten. Når de er sådd, kan hele differensieringsfasen av kult…

Discussion

Den komplekse karakteren av myelinasjons-/remyelinasjonsprosesser og demyelinerende hendelser gjør utviklingen av prediktive in vitro-systemer ekstremt utfordrende. De mest brukte in vitro narkotika screening systemer er for det meste menneskelige cellelinjer eller primære rene OL-kulturer, med økende bruk av mer komplekse co-kulturer eller organotypiske systemer¹⁵. Selv om slike systemer er kombinert med høyinnholdsteknologier, forblir rene OL-kulturer den valgte metoden når du utvikler scre…

Materials

96-well plates – untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426