Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken
Summary
Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.
Abstract
Onderzoeken naar zowel de pathofysiologie als therapeutische doelen in spierdystrofieën zijn belemmerd door de beperkte proliferatieve capaciteit van menselijke myoblasten. Er zijn verschillende muismodellen gemaakt, maar ze vertegenwoordigen niet echt de menselijke fysiopathologie van de ziekte of zijn niet representatief voor het brede spectrum van mutaties bij mensen. De vereeuwiging van menselijke primaire myoblasten is een alternatief voor deze beperking; het is echter nog steeds afhankelijk van spierbiopsieën, die invasief zijn en niet gemakkelijk beschikbaar zijn. Huidbiopten zijn daarentegen gemakkelijker te verkrijgen en minder invasief voor patiënten. Fibroblasten afgeleid van huidbiopten kunnen worden vereeuwigd en getransdifferentieerd in myoblasten, waardoor een bron van cellen met een uitstekend myogen potentieel wordt geboden. Hier beschrijven we een snelle en directe herprogrammeringsmethode van fibroblast in een myogene afstamming. Fibroblasten worden getransduceerd met twee lentivirussen: hTERT om de primaire cultuur te vereeuwigen en een tet-inducerende MYOD, die bij toevoeging van doxycycline de omzetting van fibroblasten in myoblasten induceert en vervolgens myotubes rijpt, die late differentiatiemarkers uitdrukken. Dit snelle transdifferentiatieprotocol is een krachtig instrument om pathologische mechanismen te onderzoeken en innovatieve gengebaseerde of farmacologische biotherapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken.
Introduction
Cellulaire modellen die rechtstreeks uit menselijke weefsels worden verkregen, zijn nuttig om veel menselijke genetische aandoeningen te modelleren, met het voordeel dat ze de oorspronkelijke genomische context hebben en in veel gevallen dezelfde moleculaire en cellulaire kenmerken reproduceren die bij de patiënten worden waargenomen. Op het gebied van neuromusculaire aandoeningen zijn spierbiopten een grote bron van menselijke myoblasten geweest en hebben ze geholpen bij de opheldering van pathologische mechanismen. Bovendien zijn ze een belangrijk hulpmiddel voor in vivo testen van geneesmiddelen en gentherapieën. Aan de ene kant is de afleiding van myoblasten uit spierfragmenten relatief eenvoudig. Aan de andere kant zijn de cultuur en het onderhoud van primaire myoblasten uitdagend, vanwege hun beperkte proliferatiesnelheid en replicatieve senescentie in vitro1. Een alternatief voor deze beperkingen is het vereeuwigen van myoblasten met het inbrengen van de menselijke telomerase (hTERT) en/of cycline-afhankelijke kinase 4 (CDK4) genen2,3, met behoud van skeletspierkenmerken4. Niettemin is de obtentie van primaire myoblasten nog steeds afhankelijk van spierbiopsie, een chirurgische procedure met nadelen voor de patiënten, die in veel gevallen hun spieren in geavanceerde degeneratie hebben. De spier van deze patiënten bestaat dus uit een aanzienlijk deel van het fibrotische en/of vetweefsel en levert minder spiercellen op, waardoor de cellen eerder moeten worden gezuiverd tot de vereeuwiging.
In tegenstelling tot spierbiopten zijn huidbiopten toegankelijker en minder schadelijk voor patiënten. Primaire fibroblasten kunnen in vitroworden afgeleid uit huidfragmenten . Hoewel fibroblasten niet voornamelijk worden beïnvloed door mutaties die neuromusculaire aandoeningen veroorzaken, kunnen ze worden getransdifferentieerd in myoblasten. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van het Myod-gen, een myogene transcriptiefactor5. In dit manuscript beschrijven we het protocol om getransdifferentieerde myoblasten te verkrijgen, van de oprichting van fibroblastenculturen tot de obtentie van gedifferentieerde myostubes (een representatieve samenvatting van de methode is afgebeeld in figuur 1).
Preklinisch testen van therapeutische strategieën is afhankelijk van cellulaire en dierlijke modellen met mutaties die vergelijkbaar zijn met de mutaties die bij menselijke patiënten worden gevonden. Hoewel de ontwikkeling van diermodellen haalbaarder is geworden met de opmars van genbewerkingstechnologieën zoals CRISPR/Cas96, is het nog steeds uitdagend en kostbaar. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn dus een toegankelijke optie om modellen te hebben, die het grote spectrum van mutaties van ziekten zoals Duchenne spierdystrofie (DMD) bestrijken. Obtention en creatie van celmodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën voor dergelijke pathologieën.
Onder gepersonaliseerde therapieën die zijn onderzocht, exon skipping strategieën is een van de veelbelovende voor verschillende spierdystrofieën7,8. Deze strategie bestaat uit het produceren van een korter maar functioneel eiwit. Dit wordt uitgevoerd door de exon-definitie te verbergen voor het spliceosome, waardoor de gemuteerde exon wordt uitgesloten van de laatste boodschapper. Dit is een veelbelovende technologie die is goedgekeurd door de FDA voor DMD. Zo beschrijven we in dit protocol ook methoden om myoblasten te transfecteren met twee verschillende exon skipping gerelateerde technologieën: antisense oligonucleotiden (AON) en U7snRNA-adeno-geassocieerd virus (AAV). AON-transfectie is een goed hulpmiddel voor de eerste screening van verschillende sequenties die zijn ontworpen om exon skipping9te bevorderen. De activiteit van AON’s is echter van voorbijgaande aard. Om een aanhoudende expressie van antisense sequenties te verkrijgen, onderzochten we ook kleine nucleaire RNA’s (snRNA’s) in combinatie met AAV, waardoor nucleaire lokalisatie en opname in de splicingmachines mogelijk werd10. U7 is een snRNA dat betrokken is bij de verwerking van histon mRNA dat kan worden ontworpen om eiwitten te binden die het naar het spliceosome zullen leiden en antisense sequenties11zullen leveren. Het gebruik van gewijzigde U7-snRNA ‘s in combinatie met AAV-vectoren overwint beperkingen van AION ‘s , wat resulteert in een voortdurende expressie van de AION ‘s en een betere transductie van aandachtsweefsels12. We gebruiken cellen afgeleid van DMD-patiënten voor dit protocol om de exon-skippingstrategie te illustreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om FM-cellijnen van goede kwaliteit te verkrijgen, zijn sommige stappen van cruciaal belang. Hoe eerder de huidbiopsie wordt verwerkt, hoe groter de kans op het verkrijgen van gezonde fibroblasten. Het passageaantal fibroblastenculturen is ook belangrijk. Primaire cellen hebben een beperkte proliferatieve capaciteit en na vele passages komen ze binnen in replicatieve senescentie. Het is dus beter om een voorraad fibroblasten te hebben met een laag passagenummer en cellen zo snel mogelijk te transformeren.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Vincent Mouly bedanken voor het delen van zijn kennis in het verleden over het model. Dit werk is ondersteund door het Us National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., en R.B.W.)), de Us National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., en N.W.). N.W. heeft fellowship-steun ontvangen van de Ohio State University /Nationwide Children’s Hospital Muscle Group en de Philippe Foundation. Dit werk werd ook ondersteund door interne discretionaire fondsen en een deel van het exon 2 overslaande werk werd ook ondersteund door CureDuchenne (K.M.F.) en Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 en IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Biologie du développement. 265 (2), 294-301 (2004).
