न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए चिकित्सा की जांच करने के लिए मायोब्लास्ट में मानव फाइब्रोब्लास्ट का प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल मायोब्लास्ट में त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के रूपांतरण और मायोट्यूब में उनके भेदभाव का वर्णन करता है। सेल लाइनें न्यूरोमस्कुलर विकारों वाले रोगियों से प्राप्त होती हैं और इसका उपयोग रोग तंत्र की जांच करने और चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
मस्कुलर डिस्ट्रोफीज में रोगविज्ञान और चिकित्सीय लक्ष्यों दोनों की जांच मानव मायोब्लास्ट की सीमित प्रसार क्षमता से बाधित हुई है । कई माउस मॉडल बनाए गए हैं लेकिन वे या तो वास्तव में बीमारी के मानव फिजियोपैथोलॉजी का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं या मनुष्यों में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों के व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रतिनिधि नहीं हैं। मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट का अमरीकरण इस सीमा का एक विकल्प है; हालांकि, यह अभी भी मांसपेशियों की बायोप्सी पर निर्भर है, जो आक्रामक हैं और आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इसके विपरीत, त्वचा बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं और रोगियों के लिए कम आक्रामक. त्वचा बायोप्सी से प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट को अमर और मायोब्लास्ट में स्थानांतरित किया जा सकता है, जो उत्कृष्ट मायोजेनिक क्षमता वाली कोशिकाओं का स्रोत प्रदान करता है। यहां, हम एक मायोजेनिक वंश में फाइब्रोब्लास्ट की एक तेज और प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग विधि का वर्णन करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट को दो लेंटीवायरस के साथ स्थानांतरित किया जाता है: प्राथमिक संस्कृति और टीईटी-अकक्षीय MYODको अमर करने के लिए एचटीईआरटी, जो डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा, फाइब्रोब्लास्ट के रूपांतरण को मायोब्लास्ट में लाती है और फिर मायोट्यूब्स को परिपक्व करती है, जो देर से भेदभाव मार्कर व्यक्त करती है। यह त्वरित अंतरप्रदर्शन प्रोटोकॉल पैथोलॉजिकल तंत्र की जांच करने और न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए अभिनव जीन-आधारित या औषधीय बायोथेरेपी की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
मानव ऊतकों से सीधे प्राप्त सेलुलर मॉडल कई मानव आनुवंशिक विकारों को मॉडल करने के लिए उपयोगी होते हैं, मूल जीनोमिक संदर्भ होने के लाभ के साथ और, कई मामलों में, रोगियों में मनाए गए एक ही आणविक और सेलुलर हॉलमार्क को पुन: उत्पन्न करते हैं। न्यूरोमस्कुलर विकारों के क्षेत्र में, मांसपेशियों की बायोप्सी मानव मायोब्लास्ट का एक बड़ा स्रोत रही है और रोग तंत्र की स्पष्टता में मदद की है। इसके अतिरिक्त, वे दवाओं और जीन चिकित्सा के वीवो परीक्षण में के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । एक तरफ, मांसपेशियों के टुकड़ों से मायोब्लास्ट का व्युत्पन्न अपेक्षाकृत आसान है। दूसरी ओर, प्राथमिक मायोब्लास्ट की संस्कृति और रखरखाव चुनौतीपूर्ण हैं, क्योंकि उनकी सीमित प्रसार दर और विट्रो1में प्रतिकृति सेनेसेंस है। इन सीमाओं के लिए एक विकल्प यह है कि कंकाल की मांसपेशीविशेषताओंके संरक्षण के साथ मानव टेलोमेरेज(एचटीआरटी)और/या साइक्लिन-डिपेंडेंट किनेज़ 4 (सीडीके4)जीन2,3के सम्मिलन के साथ मायोब्लास्ट को अमर किया जाए । फिर भी, प्राथमिक मायोब्लास्ट का अपमान अभी भी मांसपेशियों की बायोप्सी पर निर्भर है, रोगियों को नुकसान के साथ एक शल्य प्रक्रिया, जो कई मामलों में, उन्नत पतन में उनकी मांसपेशियों की है। इस प्रकार, इन रोगियों की मांसपेशी फाइब्रोटिक और/या एडीपोज ऊतक के एक महत्वपूर्ण अनुपात से बना है और कम मांसपेशियों की कोशिकाओं की पैदावार, अमरीकरण के लिए पहले कोशिकाओं की शुद्धि की आवश्यकता होती है ।
मांसपेशियों की बायोप्सी के विपरीत, त्वचा बायोप्सी अधिक सुलभ होती है और रोगियों के लिए कम हानिकारक होती है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट विट्रो मेंत्वचा के टुकड़ों से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि फाइब्रोब्लास्ट मुख्य रूप से न्यूरोमस्कुलर विकारों के कारण म्यूटेशन से प्रभावित नहीं होते हैं, उन्हें मायोब्लास्ट में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह मायोड जीन, एक मायोजेनिक नियामक प्रतिलेखन कारक5के सम्मिलन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में, हम फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना से लेकर विभेदित मायोट्यूब (विधि का एक प्रतिनिधि सारांश चित्र 1 में चित्रित किया गया है) की स्थापना से ट्रांसफेडेड मायोब्लास्ट प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
चिकित्सीय रणनीतियों का पूर्व-नैदानिक परीक्षण मानव रोगियों में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों के समान उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले सेलुलर और पशु मॉडलों पर निर्भर करता है। हालांकि पशु मॉडलों का विकास CRISPR/Cas96जैसी जीन-संपादन प्रौद्योगिकियों के अग्रिम के साथ अधिक व्यवहार्य हो गया है, यह अभी भी चुनौतीपूर्ण और महंगा है । इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनें मॉडल रखने के लिए एक सुलभ विकल्प हैं, जो डफेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) जैसे रोग के उत्परिवर्तनों के बड़े स्पेक्ट्रम को कवर करती हैं। इस तरह की विकृतियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा के विकास के लिए सेल मॉडल का अस्पष्टीकरण और निर्माण महत्वपूर्ण हैं।
जिन व्यक्तिगत उपचारों की जांच की गई है, उनमें से एक लंघन रणनीतियां विभिन्न मस्कुलर डिस्ट्रोफीज7,8के लिए आशाजनक लोगों में से एक हैं। इस रणनीति में एक छोटा लेकिन कार्यात्मक प्रोटीन का उत्पादन होता है। यह स्प्लिसेकोसोम के लिए एक्सोन परिभाषा को छुपाकर किया जाता है, इसलिए अंतिम दूत से उत्परिवर्तित एक्सोन को छोड़कर। यह एक बहुत ही आशाजनक तकनीक है जिसे एफडीए द्वारा डीएमडी के लिए अनुमोदित किया गया है। इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल में भी वर्णन करते हैं, दो अलग-अलग एक्सोन लंघन संबंधित प्रौद्योगिकियों के साथ मायोब्लास्ट को स्थानांतरित करने के तरीके: एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एओएन) और यू7स्नर्न्ना-एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी)। एऑन ट्रांसफैक्शन9को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किए गए कई दृश्यों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छा उपकरण है। हालांकि, एओएन की गतिविधि क्षणिक है। एंटीसेंस दृश्यों की निरंतर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, हमने एएवी के साथ संयुक्त छोटे परमाणु आरएनए (snRNAs) का भी पता लगाया, जिससे परमाणु स्थानीयकरण और स्प्लिसिंग मशीनरी10में शामिल किया गया । U7 एक snrna है जो हिस्टोन एमआरएनए के प्रसंस्करण में शामिल है जिसे प्रोटीन को बांधने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है जो इसे स्प्लिकोसोम में रीडायरेक्ट करेगा और एंटीसेंस सीक्वेंस11वितरित करेगा। एएवी वैक्टर के संयोजन में संशोधित U7 snRNAs का उपयोग एओएन की सीमाओं को पार करता है जिसके परिणामस्वरूप एओएन की निरंतर अभिव्यक्ति होती है और ब्याज के ऊतकों का बेहतर लेनदेन होता है12. हम इस प्रोटोकॉल के लिए DMD रोगियों से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए exon-लंघन रणनीति वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अच्छी गुणवत्ता के साथ एफएम सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए, कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं। जितनी जल्दी त्वचा बायोप्सी को संसाधित किया जाता है, स्वस्थ फाइब्रोब्लास्ट प्राप्त करने की संभावना उतनी ही अधिक हो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मॉडल के बारे में अतीत में अपने ज्ञान को साझा करने के लिए डॉ विंसेंट मौली का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (R01 NS043264 (K.M.F., द्वारा समर्थित किया गया है। और आर.B.डब्ल्यू)), अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य राष्ट्रीय गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग संस्थान (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., और N.W.) । एनडब्ल्यू को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी/राष्ट्रव्यापी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मांसपेशी ग्रुप और फिलिप फाउंडेशन से फैलोशिप सपोर्ट मिला है । इस काम को आंतरिक विवेकाधीन फंडों द्वारा भी समर्थित किया गया था और एक्सोन 2 लंघन कार्य का हिस्सा CureDuchenne (K.M.F.) और एसोसिएशन फ्रैंकाइज कॉन्ट्रे लेस मायोपैथी द्वारा भी समर्थित किया गया है। आईआरबी नंबर: आईआरबी #: आईआरबी10-00358/CR00005138 और IBCSC #: IBS00000123 ।
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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