Direkte omprogrammering av humane fibroblaster i Myoblaster for å undersøke terapier for nevromuskulære lidelser
Summary
Denne protokollen beskriver konvertering av hudfibroblaster til myoblaster og deres differensiering til myotubes. Cellelinjene er avledet fra pasienter med nevromuskulære lidelser og kan brukes til å undersøke patologiske mekanismer og for å teste terapeutiske strategier.
Abstract
Undersøkelser av både patofysiologi og terapeutiske mål i muskeldystrofier har blitt hindret av den begrensede proliferative kapasiteten til menneskelige myoblaster. Flere musemodeller er opprettet, men de representerer enten ikke virkelig sykdommens menneskelige fysipatologi eller er ikke representative for det brede spekteret av mutasjoner som finnes hos mennesker. Udødeliggjøringen av menneskelige primære myoblaster er et alternativ til denne begrensningen; Det er imidlertid fortsatt avhengig av muskelbiopsier, som er invasive og ikke lett tilgjengelige. I motsetning er hudbiopsier lettere å oppnå og mindre invasive for pasienter. Fibroblaster avledet fra hudbiopsier kan udødeliggjøres og transdifferentiated i myoblaster, noe som gir en kilde til celler med utmerket myogent potensial. Her beskriver vi en rask og direkte omprogrammeringsmetode for fibroblast til en myogen avstamning. Fibroblaster transduced med to lentivirus: hTERT å udødeliggjøre den primære kulturen og en tet-induserbar MYOD, som ved tillegg av doxycyklin induserer konvertering av fibroblaster til myoblaster og deretter modne myotubes, som uttrykker sen differensiering markører. Denne raske transdifferentiation protokollen representerer et kraftig verktøy for å undersøke patologiske mekanismer og å undersøke innovative genbaserte eller farmakologiske biotherapies for nevromuskulære lidelser.
Introduction
Cellulære modeller hentet direkte fra menneskelig vev er nyttige for å modellere mange menneskelige genetiske lidelser, med fordelen av å ha den opprinnelige genomiske konteksten og i mange tilfeller reprodusere de samme molekylære og cellulære kjennetegnene observert hos pasientene. Innen nevromuskulære lidelser har muskelbiopsier vært en stor kilde til humane myoblaster og har hjulpet til med belysning av patologiske mekanismer. I tillegg er de et viktig verktøy for in vivo testing av legemidler og genterapi. På den ene siden er avledningen av myoblaster fra muskelfragmenter relativt enkelt. På den annen side er kulturen og vedlikeholdet av primære myoblaster utfordrende, på grunn av deres begrensede spredningshastighet og repliktiv senescence in vitro1. Et alternativ for disse begrensningene er å udødeliggjøre myoblaster med innsetting av human telomerase (hTERT) og/ eller sylinavhengig kinase 4 (CDK4) gener2,3, med bevaring av skjelettmuskulatur funksjoner4. Likevel er obtensjon av primære myoblaster fortsatt avhengig av muskelbiopsi, en kirurgisk prosedyre med ulemper for pasientene, som i mange tilfeller har musklene i avansert degenerasjon. Dermed består muskelen til disse pasientene av en betydelig andel fibrotisk og / eller fettvev og gir færre muskelceller, som krever rensing av cellene tidligere til udødeliggjøring.
I motsetning til muskelbiopsier er hudbiopsier mer tilgjengelige og er mindre skadelige for pasientene. Primære fibroblaster kan avledet fra hudfragmenter in vitro. Selv om fibroblaster ikke primært påvirkes av mutasjoner som forårsaker nevromuskulære lidelser, kan de transdifferentiated til myoblaster. Dette kan oppnås ved innsetting av Myod genet, en myogen regulatorisk transkripsjon faktor5. I dette manuskriptet beskriver vi protokollen for å få transdifferentiated myoblaster, fra etablering av fibroblaster kulturer til obtensjon av differensierte myotubes (en representativ oppsummering av metoden er avbildet i figur 1).
Preklinisk testing av terapeutiske strategier er avhengig av cellulære og dyremodeller som bærer mutasjoner som ligner mutasjonene som finnes hos menneskelige pasienter. Selv om utviklingen av dyremodeller har blitt mer gjennomførbart med forkant av genredigeringsteknologier som CRISPR/Cas96,er det fortsatt utfordrende og kostbart. Dermed er pasientavledede cellelinjer et tilgjengelig alternativ for å ha modeller, som dekker det store spekteret av mutasjoner av sykdom som Duchenne muskeldystrofi (DMD). Obtensjon og opprettelse av cellemodeller er avgjørende for utviklingen av personlige terapier for slike patologier.
Blant personlige terapier som har blitt undersøkt, exon hoppe strategier er en av de lovende for ulike muskeldystrofier7,8. Denne strategien består av å produsere et kortere, men funksjonelt protein. Dette utføres ved å skjule exon definisjonen til skjøteosomet, derfor unntatt mutert exon fra den endelige budbringeren. Dette er en svært lovende teknologi som har blitt godkjent av FDA for DMD. Dermed beskriver vi også i denne protokollen, metoder for å transfect myoblaster med to forskjellige exon hoppe relaterte teknologier: antisense oligonucleotides (AON) og U7snRNA-adeno-assosiert virus (AAV). AON transfection er et godt verktøy for den første screening av flere sekvenser designet for å fremme exon hoppe9. Aktiviteten til AONer er imidlertid forbigående. For å oppnå et vedvarende uttrykk for antisense-sekvenser, utforsket vi også små kjernefysiske RNA-er (snRNAs) kombinert med AAV, slik at kjernefysisk lokalisering og inkludering i skjøtemaskineriet10. U7 er en snRNA involvert i behandlingen av histone mRNA som kan konstrueres for å binde proteiner som vil omdirigere den til spleissomet og levere antisense sekvenser11. Bruken av modifiserte U7 snRNAs i kombinasjon med AAV vektorer overvinner begrensninger av AONer som resulterer i et fortsatt uttrykk for AONer og bedre transduksjon av vev av interesse12. Vi bruker celler avledet fra DMD-pasienter for denne protokollen for å illustrere exon-skipping strategien.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å få FM-cellelinjer med god kvalitet, er noen trinn kritiske. Jo før hudbiopsien behandles, desto større er sjansene for å oppnå sunne fibroblaster. Passasjen antall fibroblaster kulturer er også viktig. Primærceller har begrenset proliferativ kapasitet, og etter mange passasjer går de inn i replikerativ senescence. Dermed er det bedre å ha et lager av fibroblaster ved et lavt passasjenummer og forvandle celler tidligst som mulig.
Et annet viktig skritt er også å ha viral prod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Vincent Mouly for å dele sin kunnskap tidligere om modellen. Dette arbeidet har blitt støttet av US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., og R.B.W.)), US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N. og N.W.). N.W. har fått støtte fra Ohio State University/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group og Philippe Foundation. Dette arbeidet ble også støttet av interne skjønnsmessige midler og en del av exon 2 hoppearbeid har blitt støttet også av CureDuchenne (K.M.F.) og Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 og IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Biologie du développement. 265 (2), 294-301 (2004).
