Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares
Summary
Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.
Abstract
Investigações sobre a fisiopatologia e alvos terapêuticos em distrofias musculares têm sido dificultadas pela capacidade proliferativa limitada de míbios humanos. Vários modelos de camundongos foram criados, mas ou eles não representam verdadeiramente a fisiopatologia humana da doença ou não são representativos do amplo espectro de mutações encontradas em humanos. A imortalização dos mizadolas primários humanos é uma alternativa a essa limitação; no entanto, ainda depende de biópsias musculares, que são invasivas e não estão facilmente disponíveis. Em contraste, as biópsias de pele são mais fáceis de obter e menos invasivas aos pacientes. Os fibroblastos derivados de biópsias de pele podem ser imortalizados e transdiferenciados em míferas, fornecendo uma fonte de células com excelente potencial miogênico. Aqui, descrevemos um método de reprogramação rápida e direta do fibroblasto em uma linhagem miogênica. Os fibroblastos são transduzidos com dois lentivírus: hTERT para imortalizar a cultura primária e um MYODindutível tet , que após a adição de doxiciclina, induz a conversão de fibroblastos em míbios e, em seguida, miotubes maduros, que expressam marcadores de diferenciação tardia. Este protocolo de transdiferenciação rápida representa uma poderosa ferramenta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias inovadoras baseadas em genes ou farmacológicas para distúrbios neuromusculares.
Introduction
Modelos celulares obtidos diretamente dos tecidos humanos são úteis para modelar muitas doenças genéticas humanas, com a vantagem de ter o contexto genômico original e, em muitos casos, reproduzir as mesmas marcas moleculares e celulares observadas nos pacientes. No campo das doenças neuromusculares, as biópsias musculares têm sido uma grande fonte de míbios humanos e têm ajudado na elucidação de mecanismos patológicos. Além disso, são uma ferramenta importante para testes in vivo de drogas e terapias genéticas. Por um lado, a derivação de míobios de fragmentos musculares é relativamente fácil. Por outro lado, a cultura e a manutenção dos myoblasts primários são desafiadoras, devido à sua taxa limitada de proliferação e senescência replicativa in vitro1. Uma alternativa para essas limitações é imortalizar mioblasts com a inserção da telomerase humana (hTERT) e/ou kinase dependente de cíclina 4(CDK4) genes2,3, com preservação das características do músculo esquelético4. No entanto, a obtenção de míbios primários ainda depende da biópsia muscular, procedimento cirúrgico com desvantagens para os pacientes, que, em muitos casos, têm seus músculos em degeneração avançada. Assim, o músculo desses pacientes é composto por uma proporção significativa de tecido fibroso e/ou adiposo e produz menos células musculares, exigindo a purificação das células anteriormente à imortalização.
Em contraste com as biópsias musculares, as biópsias da pele são mais acessíveis e são menos prejudiciais aos pacientes. Os fibroblastos primários podem ser derivados de fragmentos de pele in vitro. Embora os fibroblastos não sejam afetados principalmente por mutações que causam distúrbios neuromusculares, eles podem ser transdiferenciados em míobios. Isso pode ser alcançado pela inserção do gene Myod, um fator de transcrição regulatória miogênica5. Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para obter míbios transdiferenciados, desde o estabelecimento de culturas de fibroblastos até a obtenção de miótubos diferenciados (um resumo representativo do método é retratado na Figura 1).
O teste pré-clínico de estratégias terapêuticas depende de modelos celulares e animais portadores de mutações semelhantes às mutações encontradas em pacientes humanos. Embora o desenvolvimento de modelos animais tenha se tornado mais viável com o avanço de tecnologias de edição de genes como o CRISPR/Cas96,ainda é desafiador e caro. Assim, as linhas celulares derivadas do paciente são uma opção acessível para ter modelos, abrangendo o grande espectro de mutações de doenças como distrofia muscular de Duchenne (DMD). A obtenção e criação de modelos celulares são cruciais para o desenvolvimento de terapias personalizadas para tais patologias.
Entre as terapias personalizadas que têm sido investigadas, as estratégias de pular exon é uma das promissoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estratégia consiste em produzir uma proteína mais curta, mas funcional. Isso é feito escondendo a definição do exon para o emendamento, excluindo assim o exon mutado do mensageiro final. Esta é uma tecnologia muito promissora que foi aprovada pela FDA para DMD. Assim, também descrevemos neste protocolo, métodos para transfetar mioblasts com duas tecnologias diferentes de exon ignorando: oligonucleotídeos antissamerados (AON) e vírus associado ao U7snRNA-adeno(AAV). A transfecção AON é uma boa ferramenta para a triagem inicial de várias sequências projetadas para promover o exon skipping9. No entanto, a atividade das AONs é transitória. Para obter uma expressão sustentada de sequências antissamparadas, também exploramos pequenas RNAs nucleares (snRNAs) combinadas com AAV, permitindo a localização nuclear e a inclusão no maquináriode emendas 10. U7 é um snRNA envolvido no processamento de mRNA de histona que pode ser projetado para ligar proteínas que irão redirecioná-lo para o emendatório e entregar sequências antissameradas11. O uso de U7 snRNAs modificados em combinação com vetores AAV supera limitações de AONs resultando em uma expressão contínua das AONs e melhor transdução de tecidos de interesse12. Usamos células derivadas de pacientes DMD para este protocolo para ilustrar a estratégia de exon-skipping.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obter linhas de células FM com boa qualidade, algumas etapas são críticas. Quanto mais cedo a biópsia da pele for processada, maiores são as chances de obter fibroblastos saudáveis. O número de passagens de culturas de fibroblastos também é importante. As células primárias têm capacidade proliferativa limitada e, após muitas passagens, entram em senescência replicativa. Assim, é melhor ter um estoque de fibroblastos em um número de passagem baixo e transformar células na passagem mais antiga possív…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Vincent Mouly por compartilhar seu conhecimento no passado sobre o modelo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA de Distúrbios Neurológicos e Derrame (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.), os Institutos Nacionais de Saúde dos EUA instituto nacional de artrite e doenças musculoesqueléticos e de pele (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. recebeu apoio de bolsas da Ohio State University/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group e da Philippe Foundation. Este trabalho também foi apoiado por fundos discricionários internos e parte do trabalho de salto exon 2 foi apoiado também pela CureDuchenne (K.M.F.) e Associação Francaise Contre Les Myopathies. Número do IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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