Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı
Summary
Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.
Abstract
Golden Gate klonlama yöntemi, kullanıcı tanımlı herhangi bir düzenlemede birden fazla genin hızlı bir şekilde bire birliğini sağlar. Tanıma alanlarının dışında kesilen ve kısa bir çıkıntı oluşturan tip IIS kısıtlama enzimlerini kullanır. Bu modüler klonlama (MoClo) sistemi, organizatörler, kodlama dizileri (CDS) ve sonlandırıcılar gibi farklı DNA parçalarının ilk olarak bir giriş vektörüne klonlandırıldığı hiyerarşik bir iş akışı kullanır. Birden çok giriş vektörü daha sonra transkripsiyon birimlerine monte edilir. Birkaç transkripsiyon ünitesi daha sonra çok genli bir plazmid içine bağlanır. Golden Gate klonlama stratejisi, tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verdiği için muazzam bir avantaja sahip. Hiyerarşik iş akışı genellikle giriş vektörlerinin ötesinde sıralamaya gerek kalmadan çok çeşitli çok genli yapıların facile klonlasını sağlar. Floresan protein bırakmalarının kullanımı kolay görsel tarama sağlar. Bu çalışma, maya modüler klonlama (MoClo) kitini kullanarak çok genli plazmidlerin montajı için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Çok genli plazmid montajının optimal ve yetersiz sonuçlarını gösteriyoruz ve koloniler için tarama için bir kılavuz sağlıyoruz. Bu klonlama stratejisi maya metabolik mühendisliği ve çok genli plazmid klonlamanın gerekli olduğu diğer durumlar için oldukça geçerlidir.
Introduction
Sentetik biyoloji, farmasötik, tarım ve kimya endüstrileri için yararlı yeni işlevlere sahip biyolojik sistemler tasarlamayı amaçlamaktadır. Çok sayıda DNA parçasını yüksek verimli bir şekilde birleştirmek sentetik biyolojide temel bir teknolojidir. Böyle karmaşık bir süreç, temel mühendislik bilimlerinden ödünç alınan bir kavram olan azalan karmaşıklık ile birden fazla seviyeye ayrılabilir1,2. Sentetik biyolojide, DNA parçaları genellikle işlevselliğe göre hiyerarşik olarak bir araya gelir: (i) Parça düzeyi: “parçalar”, organizatör, kodlama dizisi, sonlandırıcı, çoğaltmanın kaynağı gibi belirli bir işleve sahip DNA parçalarını ifade eder; (ii) Transkripsiyon üniteleri (TU) seviyesi: TU, bir organizatör, bir kodlama dizisi ve tek bir geni aktarabilen bir sonlandırıcıdan oluşur; (iii) Çok genli seviye: çok genli plazmid, sıklıkla tüm metabolik yoldan oluşan birden fazla TUs içerir. BioBrick topluluğunun öncülük ettiği bu hiyerarşik derleme, sentetik biyoloji3’tebüyük DNA setlerinin montajı için temel kavramdır.
Son on yılda4,5,6,7, Golden Gate klonlama tekniği hiyerarşik DNA derlemesini önemli ölçüde kolaylaştırmıştır2. Gibson klonlama8, ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC)9, urasil eksizyon tabanlı klonlama (KULLANICI)10, ligase cycling reaksiyon (LCR)11ve in vivo rekombinasyon (DNA Assembler)12,13gibi diğer birçok çok parçalı klonlama yöntemi de şimdiye kadar geliştirilmiştir. Ancak Golden Gate klonlama ideal bir DNA montaj yöntemidir, çünkü genlere özgü dizilerden bağımsızdır ve tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verir. Golden Gate klonlama, tanıma alanı2dışında kademeli çıkıntılar oluşturmak için palindromi olmayan bir diziyi tanıyan tip IIS kısıtlama enzimlerinden yararlanır. Bir ligase daha sonra çok parçalı bir montaj elde etmek için tavlanmış DNA parçalarını birleştirir. Bu klonlama stratejisini modüler klonlama (MoClo) sistemine uygulamak, doğru monte edilmiş yapı4‘ü içeren% 90’dan fazla dönüştürücü ile 10’a kadar DNA parçasının bir araya alınmasını sağlamıştır.
MoClo sistemi, sentetik biyolojinin tasarım-inşa-test döngüsünü hızlandıran muazzam avantajlar sunar. İlk olarak, değiştirilebilir parçalar, büyük bir parametre alanını hızlı bir şekilde test etmek için kombinatoryal klonlamayı etkinleştirir. Örneğin, metabolik bir yolu optimize etmek genellikle yol akısını dengelemek için her gen için birçok promotör arasında bisiklet sürmeyi gerektirir. MoClo sistemi bu tür zorlu klonlama görevlerini kolayca halledebilir. İkincisi, plazmid kısmını sıralamak gerekir, ancak tipik olarak TU veya çok genli plazmidleri sıralamaz. Çoğu durumda, koloni PCR veya kısıtlama sindirimi ile tarama TU ve çok genli plazmid düzeyinde doğrulama için yeterlidir. Bunun nedeni, parça plazmidi klonlamanın, sık sık mutasyonları tanıtan PCR gerektiren tek adım olmasıdır. Üçüncü olarak, MoClo sistemi çok genli karmaşık metabolik yollar oluşturmak için idealdir. Son olarak, evrensel çıkıntılar nedeniyle, parça plazmidleri yeniden kullanılabilir ve tüm biyomühendislik topluluğu ile paylaşılabilir. Şu anda, MoClo kitleri bitkiler için mevcuttur14,15,5,16,17, mantar6,18,19,20,21,22, bakteri7,23,24,25,26,27vehayvanlar28,29. Çok krallıklı bir MoClo platformu da yakın zamanda tanıtıldı30.
Saccharomyces cerevisiaeiçin Lee ve ark.6, maya sentetik biyoloji topluluğu için mükemmel bir kaynak olan çok yönlü bir MoClo araç seti geliştirdi. Bu kit uygun bir 96 kuyu formatında gelir ve iyi karakterize edilmiş organizatörler, floresan proteinler, terminatörler, peptit etiketleri, seçim belirteçleri, replikasyon kaynağı ve genom düzenleme araçlarından oluşan çeşitli bir koleksiyona sahip sekiz tür değiştirilebilir DNA parçası tanımlar. Bu araç seti, beş adede kadar transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine birleştirilmiş olmasını sağlar. Bu özellikler, kısmi veya tüm yolların hedeflenen kimyasalları üretmek için aşırı ifade edildiği maya metabolik mühendisliği için değerlidir. Bu kiti kullanarak, araştırmacılar geraniol, linalool31, penisilin32, mukonik asit33, indigo34ve mayada betalain35 üretimini optimize etmişlerdir.
Burada, epizomal veya genomik ekspresyon için çok genli yollar oluşturmak için MoClo araç setinin kullanımına rehberlik etmek için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu kitin kapsamlı kullanımıyla, DNA konsantrasyonlarının doğru ölçümünün, Golden Gate reaksiyonundaki her parçanın eşitlikçi dağılımını sağlamanın anahtarı olduğunu bulduk. Ayrıca T7 DNA ligaz üzerinde T4 DNA ligazını öneririz, çünkü ilki daha fazla sayıda çıkıntla daha iyi çalışır36. Son olarak, BsmBI ve BsaI’nin tüm iç tanıma siteleri montajdan önce kaldırılmalı veya evcillendirilmelidir. Alternatif olarak, birden fazla dahili siteyi kaldırmak ve eşzamanlı kodon optimizasyonu elde etmek için parçaları sentezlemeyi düşünebilirsiniz. S. cerevisiae’de β karoten ve likopen üretimi için beş genlik bir yol ifade ederek bu araç setin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, bu kitin genom düzenleme araçlarını kullanarak ADE2 locus’un nasıl nakavt olduğunu gösteriyoruz. Bu renk tabanlı deneyler kolay görselleştirme için seçildi. Ayrıca Golden Gate klonlama kullanarak füzyon proteinlerinin nasıl üretilip amino asit mutasyonlarının nasıl oluşturulacağı da göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lee ve arkadaşları tarafından geliştirilen MoClo tabanlı klonlama kiti, maya genomuna çoğaltma veya entegrasyon için bir ila beş transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine hızlı bir şekilde montajı için mükemmel bir kaynak sağlar. Bu kitin kullanımı, mayadaki birden fazla geni ifade etmek için sıklıkla var olan zaman alıcı klonlama darboğazını ortadan kaldırır.
T4 DNA ligaz ile Golden Gate klonlamanın sindirim/ligasyon döngüleri için beş farklı k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma New York Eyalet Üniversitesi Araştırma Vakfı (Ödül #: 71272) ve Buffalo Üniversitesi IMPACT Ödülü (Ödül #: 000077) tarafından finanse edildi.
Materials
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Génétique. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker’s yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M., Valla, S., Lale, R. . DNA Cloning and Assembly Methods. 1116, 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R., et al. . The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. 11, 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
