Alla djurförsök utfördes under licensen ZH152/17 i enlighet med standarder och förordningar från Cantonal Ethics Commission Zurich och EPIC animal facility vid Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich. OBS: Detta protokoll börjar med borttagning av H19- och IG-DMR i phaESCs. Mer information om hur du upprättar phaESC-linjer finns i publicerade rapporter10,13. En översikt och tidsram för detta protokoll (steg 1–14) finns i figur 1A. media, lösningar och buffertar visas i tabell 1. Förfarandet för att upprätta DKO-phaESC-linjer (steg 1–6) visas i figur 1B, och strategin för att konstruera halvklonerade embryon (steg 7–14) visas i figur 1C. 1. Transfection av plasmider för radering av H19-DMR och IG-DMR i phaESCs Förbered CRISPR/Cas9-plasmider för samuttryck av Cas9-nukleaser och vägleda RNAs för att rikta borttagningar av H19-DMR och IG-DMR. Ligate fyra par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R listad i tabell 2) i pX330 plasmider.OBS: Se det publicerade protokollet om det detaljerade förfarandet för beredning av dessa 4 CRISPR/Cas9-plasmider14. Alternativt är plasmider tillgängliga för allmänna musstammar också tillgängliga via ett arkiv (Materialförteckning ). Täck ytan på en brunn på en 6-brunnsplatta med 1 ml 0,2% gelatinlösning genom inkubation vid 37 °C i 10 min. Platta 2 × 105 vildtypsfaser på den gelatinbelagda brunnen i haESC-medium utan antibiotika och inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 1 dag.OBS: Antibiotika utelämnas från mediet för att öka effektiviteten hos den efterföljande lipofection. Vi använde wildtype phaESCs vid passage 10. Vi rekommenderar att du använder tidiga passagefaser, men en mängd olika passagenummer har framgångsrikt använts8. Sambandet mellan passagenummer och effektivitet för att erhålla halvklonerade embryon och möss är för närvarande inte känt. Transfekta phaESCs i brunnen på en 6-brunnsplatta (från steg 1.3) med 6 plasmider samtidigt med lipofection reagens: 50 ng piggyBac plasmid som bär en CAG-EGFP transgene, 50 ng piggyBac transposase plasmid och 600 ng av var och en av de 4 CRISPR/Cas9 plasmiderna (från steg 1.1). Se tillverkarens protokoll om detaljerad procedur för transfektionen.OBS: Två piggyBac plasmider används för att integrera en transposon för allestädes närvarande uttryck av förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) i arvsmassan hos phaESCs. Om GFP-märkning av cellerna inte krävs kan dessa två plasmider ersättas med en CRISPR/Cas9-plasmid för övergående uttryck av fluorescensproteiner (t.ex. pX458-plasmid) i stället för en av pX330-plasmiderna. Övergående EGFP-uttryck kan sedan användas för sortering av transfekterade celler. Två dagar efter transfekten, aspirera mediet och tillsätt 800 μL trypsin. Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär i 5 min. Tillsätt sedan 2 ml tvättbuffert för att släcka trypsin och pipett flera gånger för att få en enda cellfjädring. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten. Återanvänd cellpelleten i 400 μL haESC underhållsbuffert kompletterad med 15 μg/mL Hoechst 33342.OBS: För att minska den potentiella toxiciteten hos Hoechst 33342 har 1 μg/mL Hoechst 33342 och 50 μM verapamil använts i stället för 15 μg/mL Hoechst 3334215. Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 15 min. Efter inkubationen överför du cellfjädringen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock och håller röret vid 4 °C tills det är klart att användas i nästa steg (avsnitt 2). 2. Encellig plätering av transfekterade phaESCs med hjälp av en flödescytometer En dag före sortering av de transfected phaESCs, platt bestrålade mus embryonala fibroblaster (MEFs) på gelatinbelagda 96-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF medium. Vanligtvis är 6 plattor beredda att upprätta en phaESC-linje med riktade borttagningar. Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.OBS: Bestrålade MEF:er är kommersiellt tillgängliga. Vi använder MEF som härrör från E12.5 embryon från DR4 möss. Även om haESCs kan växa på gelatinbelagda plattor utan MEF, rekommenderar vi MEF för att öka livskraften hos sorterade enskilda haESCs. På sorteringsdagen aspirerar du MEF-mediet från 96-brunnsplattorna och lägger till 120 μL färskt haESC-medium per brunn. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Ställ in en cellsorterare med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner. En 355 nm UV-laser och en 488 nm blå laser används för excitation av Hoechst 33342 respektive EGFP fluorescens.OBS: Alternativt kan Hoechst 33342 detekteras genom excitation med 405 nm. Sortera de transfecterade falangerna i 5 ml-röret (från steg 1.10) med hjälp av en grind för insamling av haploidceller i G1/S-fasen som visar EGFP-uttryck. Sätt in en enda cell i varje brunn på 96-brunnsplattorna från steg 2.2.OBS: Påvisande av Hoechst 33342 färgning skiljer i allmänhet 3 toppar av celler med en DNA-halt på 1n, 2n och 4n, som motsvarar haploida celler i G1-fas, en blandning av haploida celler i G2/M-fas och difadceller i G1-fas och difadceller i G2/M-fas, respektive. Haploidceller vid G1/S fas identifieras som toppen med lägre intensitet av Hoechst 33342 fluorescens. Ett representativt resultat och en sorteringsport visas i figur 2A. Efter plätering, inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. 3. Subkloning av transfekterade phaESCs Tre dagar efter encellig plätering kan kolonier observeras i flera brunnar av 96-brunnsplattorna under ett mikroskop. Markera brunnarna där endast enstaka kolonier växer.OBS: Enligt vår erfarenhet observerades enstaka kolonier i 20%-40% av brunnarna i 96-brunnsplattorna. På dag 4 efter encellig plätering, ersätt hälften av mediet med nytt haESC-medium i brunnarna med enstaka kolonier. En dag före passaging (dag 4 eller 5 efter encellig plätering) bestrålade plattan MEFs på gelatinbelagda 96-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Efter 5 eller 6 dagars encellig plätering, välj brunnar av de 96-brunnsplattor som innehåller enstaka kolonier med en diameter större än 150 μm.OBS: Cirka 100 brunnar väljs företrädesvis för att upprätta en phaESC-linje med de riktade DMR-borttagningarna. Aspirera mediet i de valda brunnarna och tillsätt 30 μL trypsin. Inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 5 min. Tillsätt sedan 30 μL tvättbuffert till varje brunn för att släcka trypsinet. Tillsätt 140 μL haESC-medium i varje brunn och pipett flera gånger för att få enstaka celler. Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 96-brunnsplattorna som är beredda i steg 3.3. Överför phaESCs från varje brunn från steg 3.6 till en frisk brunn av den nya 96-brunnsplattan från steg 3.7. Inkubera 96-brunnsplattorna som innehåller phaESC-subkloner vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. Nästa dag aspirerar du allt medium från varje brunn och lägger till 120 μL nytt haESC-medium. Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. En dag innan cellerna blir konfluenta för passaging, plätera de bestrålade MEF:erna på gelatinbelagda 24-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. När phaESCs har blivit confluent för passaging, aspirera mediet och tillsätt 30 μL trypsin. Inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt 90 μL tvättbuffert i varje brunn för att släcka trypsinet. Pipett flera gånger för att få enstaka celler. Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 24-brunnsplattorna från steg 3.11 och tillsätt 600 μL färskt haESC-medium. Överför 60 μL av suspensionen av phaESC-subkloner från varje brunn i steg 3.13 till en ny brunn på 24-brunnsplattorna från steg 3.14. Förvara den återstående suspensionen av varje phaESC-subclone för DNA-extraktion och genotypning i steg 4. Inkubera 24-brunnsplattorna med phaESC-subdukarna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. En dag innan cellkulturerna når tätheten för passaging, plätera de bestrålade MEF:erna på gelatinbelagda 6-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. När phaESCs blir tillräckligt sammanflöde för passaging, aspirera mediet och tillsätt 250 μL trypsin. Inkubera 24-brunnsplattorna vid 37 °C i 5 minuter.OBS: Efter genotypning i steg 4.9 behöver endast phaESC-linjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR passeras. Tillsätt 750 μL tvättbuffert i varje brunn för att släcka trypsinet. Pipett flera gånger för att få en enda cellfjädring. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min, ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i 2 ml haESC-medium. Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 6-brunnsplattorna från steg 3.17. Överför phaESC-fjädringen från varje rör från steg 3.20 till en ny brunn. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Expandera cellklonerna genom att upprepa steg 3.17 till 3.21 och öka plåtstorleken och volymerna av trypsin, tvättbuffert och haESC-medium. Förbered en T25-kolv för varje subklonerad phaESC-linje av MEF:er för steg 5.OBS: Vi rekommenderar att du fryser en alikvot av varje subklonerad phaESC-linje i 300 μL frysmedel och håller en kryostock i flytande kvävelagring innan du fortsätter till steg 5. 4. Första genotypningen av subklonerade phaESC-linjer med MEF För att extrahera genomiskt DNA från den återstående cellupphängningen från steg 3.15, tillsätt 200 μL lysbuffert till varje brunn på 96-brunnsplattorna. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Skölj varje brunn med ytterligare 200 μL lysbuffert för att återställa alla återstående celler och samla i samma 1,5 ml-rör. Inkubera 1,5 ml-röret vid 55 °C i 3 timmar vid blandning. Efter inkubation tillsätt 460 μL isopropanol till varje 1,5 ml-rör och blanda försiktigt tills ett DNA-fällning blir synligt. Centrifugera rören ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Tvätta DNA-pelletsen med 200 μL 70% etanol. Centrifugera rören ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Torka rören i luft i 10 minuter och återanvänd sedan DNA:t i 20 μL vatten. Utför polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av termoserbart DNA-polymeras enligt tillverkarens protokoll.OBS: Primerparen för PCR anges i tabell 2 och används enligt följande: H19-DMR-P1 och P3 (407 bp för borttagen H19-DMR); H19-DMR-P2 och P3 (623 bp för vildtyp H19-DMR); IG-DMR-P1 och P3 (319 bp för borttagen IG-DMR); IG-DMR-P2 och P3 (492 bp för wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen för PCR för alla primerpar är följande: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Längden på förstärkta DNA-fragment för H19- DMR-och IG-DMR-borttagningar visar viss variation på grund av icke-homolog end joining associerad med CRISPR / Cas9-medierad redigering. PhaESCs odlades med MEFs, som innehåller wildtype H19-DMR och IG-DMR DNA. Därför är primerpar av H19-DMR-P2/P3 och IG-DMR-P2/P3, som förstärker vilda DNA-fragment, inte informativa. Dessa primerpar ingår dock som kontroller och bör ge ett band i alla reaktioner. Analysera PCR-fragmenten med agarose gel elektrofores. Se det publicerade protokollet om det detaljerade förfarandet för elektroforesen16. Identifiera cellinjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR. En representativ bild av elektrofores visas i figur 2B.OBS: I vårt fall identifierades åtta cellinjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR bland 135 subklonerade phaESC linjer. 5. Haploidcellrening av subklonade phaESC-linjer När de subklonerade phaESC-kulturerna i T25-flaskorna från steg 3.22 blir tillräckligt täta för passaging, aspirera mediet och tillsätt 1,5 ml trypsin. Inkubera kolven vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt sedan 4,5 ml tvättbuffert och pipett flera gånger för att få en encellig suspension. Överför varje cellfjädring till ett 15 ml-rör och centrifugera röret vid 160 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelletsen i 400 μL haESC underhållsbuffert kompletterad med 15 μg/mL Hoechst 33342. Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i 15 minuter. Efter inkubationen överför du cellupphängningen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock. Skölj cellsillocket med ytterligare 400 μL haESC underhållsbuffert och samla de återstående cellerna i samma 5 ml-rör. Håll röret vid 4 °C tills det är klart att sorteras. Ställ in en flödescytometer med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner.OBS: Hoechst 33342 kan detekteras genom excitation vid 405 nm. Här används en 355 nm UV-laser för detektion av Hoechst 33342. Ställ in cellfjädringen (från steg 5.3) och ett nytt 15 ml-rör som innehåller 2 ml haESC underhållsbuffert för att samla sorterade celler i flödescytometern. Starta analysen och ställ in sorteringsporten för att samla haploidceller i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A för identifiering av G1/S-fasfasens phaESC-population.OBS: Vissa subklonerade phaESC-linjer kanske inte innehåller några haploidceller på grund av fullständig diploidisering eller felaktig plätering av diploidceller i steg 2. Om haploida celler inte observeras i G1/S-fasen, fortsätt till ett annat prov utan sortering. I vårt fall innehöll 5 cellinjer haploida celler och 3 cellinjer innehöll endast diploid celler av 8 sub-klonade phaESC linjer. Efter cellsortering, tillsätt 5 ml tvättbuffert längs väggen på 15 ml uppsamlingsrör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min. Ta bort supernaten. Välj en tallrik med lämplig storlek för odling beroende på antalet sorterade celler. Använd en enda brunn av en 96-brunnsplatta, en 24-brunnsplatta och en 12-brunnsplatta för att odla 1 000–40 000 celler, 40 000–200 000 celler respektive 200 000–400 000 celler. Återanvänd cellpelleten i 120 μL, 600 μL respektive 1,2 ml haESC-medium.OBS: Plätera cellerna med hög densitet eftersom låg sammanflöde kan orsaka celldöd i cellerna efter sortering. Från och med nu odlas phaESCs på gelatinbelagda brunnar utan MEF för att underlätta genotypning i steg 6 och efterföljande applicering för intracytoplasmisk injektion från steg 9. Efter överföring av cellfjädringen till en gelatinbelagd brunn av lämplig storlek, inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. Fortsätt att expandera phaESC-kulturerna genom att upprepa steg 3.18 till 3.21 med ökande plåtstorlekar och ökande volymer trypsin, tvättbuffert och haESC-medium. Cellerna odlas på gelatinbelagda brunnar utan MEF. För varje subklonerad phaESC-linje, förbered en kultur i en brunn av en 24-brunnsplatta och en brunn av en 6-brunnsplatta för steg 6 respektive 9.OBS: Vissa celler i varje subklonerad phaESC-linje bör frysas i 300 μL frysmedel som en kryostock i en flytande kvävelagringstank innan de fortsätter till steg 9. 6. Andra genotypningen av subklonerade phaESC-linjer utan MEF OBS: En andra omgång genotypning utförs för att bekräfta att de subklo klonade phaESC-linjerna har borttagningar av både H19- och IG-DMR, och att wildtype alleler är frånvarande efter avlägsnandet av MEF. Bekräfta under mikroskopet att kulturerna i brunnar på 24-brunnsplattorna från steg 5.11 är fria från MEF: er.OBS: Om MEF observeras är det nödvändigt att fortsätta passa kulturerna tills MEF har försvunnit för att undvika att förorena PCR med vildtyps-DNA från MEF. Aspirera mediet från konfluenta kulturer och tillsätt 400 μL lysbuffert per brunn på 24-brunnsplattan. Efter pipetting flera gånger, överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Inkubera 1,5 ml-röret vid 55 °C i 3 timmar vid blandning. Efter inkubation tillsätt 400 μL isopropanol till 1,5 ml-röret och blanda försiktigt tills ett DNA-fällning blir synligt. Centrifugera röret ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Tvätta DNA-pelleten med 200 μL 70% etanol. Centrifugera röret ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Torka röret i luften i 10 minuter och återanvänd sedan DNA:t i 50 μL vatten. Utför genotypning PCR efter steg 4.7 och gelelektrofores i steg 4.8 för att identifiera cellinjer, som har borttagningar av både H19- och IG-DMRs och är fria från wildtype alleler.OBS: En bild av en typisk andra genotypningsanalys visas i figur 2B som referens. I vårt fall var alla 5 cellinjer som valts efter haploid cell rening (steg 5) fria från wildtype alleler och besatt endast borttagning alleler av H19- och IG-DMRs. Använd de subklonerade phaESC-linjerna som valts efter denna andra genotypning som DKO-phaESC-linjer. 7. Superovulation av möss För produktion av MII oocyter, initiera superovulation genom intraperitoneal injektion av 5 IE av gravida mare serum gonadotropin (PMSG) lösning i varje B6D2F1 kvinnliga mus (4-5 veckor gammal) 63-65 h före oocyte samling.OBS: B6D2F1 mus stam rekommenderas för detta protokoll eftersom B6D2F1 äggceller tolerera intracytoplasmic injektion väl och visa hög utvecklingspotential efterförfarandet 17. Fyrtioåtta timmar efter PMSG injektion, intraperitoneally injicera 5 IE av mänskliga chorionic gonadotropin lösning i varje mus. 8. Oocytsamling Förbered en 4-brunnsplatta som innehåller 700 μL hyaluronidase medium i en brunn och 700 μL M2-medium i de återstående 3 brunnarna. Förbered dessutom en 6 cm skål med 7 ml M2 medium och en mittbrunnsform med 900 μL M16 medium. Förvärm tallriken och disken vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. På dagen för intracytoplasmic injektion, avliva superovulated honor (från steg 7,2) genom antingen massundersökning förskjutning eller CO2 inandning runt 8 AM på morgonen. Dissekera ovidukterna med pincett och sax. Placera ovidukterna i 6 cm skålen med M2 medium. Släpp cumulus-oocytekomplexen (COC) genom att riva ampullan i äggkanalerna med en 30 G nål. Överför COC till förvärmt hyaluronidase medium och förvara vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Efter 2-3 min, samla cumulusfria äggceller med en munpipett och tvätta äggcellerna 3 gånger genom att överföra dem till färskt M2-medium i de andra 3 brunnarna på 4-brunnsplattan. Samla metafas II (MII) äggceller, som har första polära kroppar, i en center-well skål med M16 medium och håll plattan vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär tills den används för intracytoplasmic injektion i steg 12. 9. Behandling och insamling av DKO-phaESCs Förbered en DKO-phaESC-kultur i en brunn av en 6-brunnsplatta utan MEF vid 60-80% konfluency en dag före intracytoplasmic injektionen (från steg 5.11). För att inducera cellcykelstopp i M-fas, aspirera mediet helt och tillsätt 2 ml haESC-medium som innehåller 0,05 mg/mL demecolcine. Efter 8 h demecolcinebehandling, aspirera mediet och tillsätt 800 μL trypsin. Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 5 min och tillsätt sedan 2 ml tvättbuffert för att släcka trypsin och pipett flera gånger för att få en encellig suspension. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten. Återanvänd cellpelleten i 400 μL haESC underhållsbuffert som innehåller 15 μg/mL Hoechst 33342. Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 15 min. Efter inkubationen överför du cellfjädringen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock och håller röret vid 4 °C tills cellsortering i steg 10. 10. Rening av M-fas-arresterade DKO-phaESCs Ställ in en flödescytometer med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner.OBS: Hoechst 33342 kan detekteras genom excitation vid 405 nm. Här används en 355 nm UV-laser för detektion av Hoechst 33342. Ställ in de M-fas-arresterade DKO-falangerna från steg 9.7 och starta analysen. Välj en lämplig sorteringsport för insamling av haploid M-fasceller (2n) från provet behandlat med demecolcine.OBS: Efter behandling med demecolcine förväntas 2 cellpopulationer, motsvarande haploida och diploid M-fas-arresterade celler som visas i figur 3B. Cellcykeln gripande efter demecolcine behandling är klar, således observeras ingen haploid 1n DNA topp. Detta är viktigt eftersom haploid M-fasceller och diploid G1-celler har samma DNA-innehåll (2n) och skulle producera överlappande toppar. Sätt upp ett 15 ml-rör som innehåller 2 ml haESC underhållsbuffert för att samla de sorterade cellerna i flödescytometern. Starta cellsortering. Efter cellsortering, tillsätt 5 ml tvättbuffert längs uppsamlingsrörets vägg. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten. Återanvänd cellerna i en lämplig volym haESC underhållsbuffert för att erhålla en slutlig koncentration på 5 x 105 celler/ml. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Håll röret på is tills det är klart för intracytoplasmisk injektion i steg 12. 11. Beredning av jordbruks- och mikroinjektionspipetter OBS: För att utföra den intracytoplasmiska injektionen (steg 12) krävs flera hållande och mikroinjektionspipetter (figur 4A). Dessa pipetter kan köpas på skräddarsydd efterfrågan från en kommersiell leverantör eller tillverkas av lämpliga glaskapillärer med hjälp av en mikropipettedragare och en mikroforge. Dra borosilikatglaskapillärer på en mikropipettedragare. För att dra borosilikatglas kapillärer utan glödtråd (0,78 x 1,00 x 80 mm) anges följande parametrar för en flammande horisontell puller(Tabell över material)som referens, men kommer att skilja sig åt för andra instrument och glas kapillärtyper: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 och Pressure 200 för att hålla pipetter; Heat 510 (Ramptest 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 och Pressure 200 för mikroinjektionspipetter.OBS: De optimala parametrarna måste definieras individuellt eftersom flera faktorer, inklusive fuktighet, modellen av en mikropipettedragare och glaskapillärernas lott kan påverka form av injektionspipetterna. En långsträckt form med en gradvis avsmalning bör riktas mot. Beredning av hållröretter Ställ in en dragen kapillär beredd i steg 11.1 på en mikroforge. Placera kapillären över glaspärlan på glödtråden och sänk kapillären för att få kontakt med glaspärlan medan du värmer glödtråden. Bryt kapillären genom att stänga av värmen och lossna från glaspärlan så att dess ytterdiameter är 60–100 μm. Placera kapillärspetsen horisontellt för att möta glaspärlan på glödtråden. Värm glödtråden så att kapillärspetsens innerdiameter smälter till en diameter av 10–20 μm. Flytta kapillären så att glaspärlan placerar sig vid en punkt ~1 mm från kapillärspetsen utan kontakt. Värm glödtråden så att kapillären kan böjas i 20° vinkel. Demontera kapillären, som kallas en hållrörett, från mikroforgen.OBS: För att mäta kapillärens storlek installeras helst en okularriktare i mikroforgen. Beredning av mikroinjektionspipetter Ställ in en dragen kapillär beredd i steg 11.1 på en mikroforge. Placera kapillären över glaspärlan på glödtråden och sänk kapillären för att få kontakt med glaspärlan medan du värmer glödtråden. Bryt kapillären genom att stänga av värmen och lossna från glaspärlan i ett läge där dess ytterdiameter är 6 μm. Flytta kapillären så att glaspärlan placerar sig vid en punkt ~1 mm från kapillärspetsen utan kontakt. Värm glödtråden så att kapillären kan böjas uppåt i 20° vinkel. Demontera mikroinjektionspipetten från mikroforgen och förvara den i en säker låda för senare användning.OBS: Mikroinjektionspipetterna bereds med följande specifikationer: ytterdiameter, 6 μm; innerdiameter, 4,5–5 μm; böjvinkel, 20°. Att definiera den optimala utformningen av mikroinjektionspipetten är viktigt för framgången för den intracytoplasmiska injektionen. För stor innerdiameter kan förhindra att plasmamembranet hos donatorn DKO-phESCs sprintureras (se diskussionsavsnitt). Om innerdiametern är för smal kan den hindra smidig pipetting av donatorn DKO-phESCs. En böjvinkel < 30° är att föredra eftersom en hög böjvinkel hindrar effekten av piezopulser. 12. Intracytoplasmisk injektion av DKO- phaESCs Före den intracytoplasmiska injektionen (från steg 12.2) bered en polyvinylpyrrolidonlösning (PVP) genom att tillsätta 5 ml M2 medium i ett 50 ml-rör som innehåller 0,6 g PVP och omröra röret på en vipp vid 4 °C i 2 dagar. När PVP har lösts upp helt filtreras lösningen sterilt och förvaras vid 4 °C. På dagen för den intracytoplasmiska injektionen, förbered en center-well skål med 900 μL KSOM medium och förvärm skålen vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Förbered en mikromanipulationsform genom att justera droppar på 5 μL PVP-lösning och 20 μL M2-medium på ett lock av en 10 cm skål som placeras upp och ner. Täck dropparna med mineralolja och placera skålen på injektionsmikroskopets scen.OBS: Det rekommenderade arrangemanget av mikromanipulationsskålen visas i figur 4B. Montera en hållpipett på mikromanipulatorn. Fyll mikroinjektionspipetten med fluorkarbonoljan med hjälp av en mikrolastarspets och montera den på piezo-ställdonet. Sänk ner mikroinjektionspipetten i en droppe med PVP-lösning och pipett upp och ner flera gånger för att täcka glaset med PVP och gör det mindre klibbigt. Ladda en liten volym PVP-lösning i mikroinjektionspipetten och flytta pipetten till en droppe med M2-medium. Sänk ner hållpipetten i M2-mediet och fokusera på pipetten i botten av droppen. Överför cirka 2 μL DKO-phaESC-suspension från steg 10,6 till M2-mediumfallet. Överför 10 MII-oocyter från steg 8,5 till samma M2 medium droppe med hjälp av en munpipett. För injektion, rotera en oocyt i M2 medium droppe så att perivitelline utrymmet vetter mot mikroinjektionspipetten, och MII-plattan är inte placerad i vägen för mikroinjektionspipeetten (Figur 4A). Håll i äggcellen genom att trycka negativt genom håll pipetten.OBS: En MII-platta identifieras visuellt som en utskjutning av ooplasm som kallas en “puckel” och ofta ligger bredvid den första polära kroppen. MII-plattan innehåller den meiotiska spindeln med bifogade kromosomer. Beröring av mikroinjektionspipetten och MII-plattan måste undvikas eftersom mekaniska skador på spindeln och kromosomerna kan störa embryoutvecklingen. Ladda en DKO-phaESC i spetsen på mikroinjektionspipetten genom att applicera skonsamt undertryck. Spräck plasmamembranet i en DKO-phaESC genom pipetting för att undvika injektion av en intakt DKO-phaESC(figur 3C; se diskussion).OBS: Om plasmamembranet i en DKO-phaESC inte spricker genom pipetting, kassera DKO-phaESC och ladda en annan DKO-phaESC. Placera mikroinjektionspipetten i kontakt med oocytens zona pellucida och applicera en liten mängd negativt tryck i mikroinjektionspipetten. Applicera piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) för att bryta igenom zonan medan du trycker spetsen på mikroinjektionspipetten mot perivitellinutrymmet. Kontrollera att MII-plattan, som innehåller en spindel och kromosomer, inte är placerad i mikroinjection-pipettens väg.OBS: Justera inställningen empiriskt till de lägsta piezopulserna för borrning genom zona för att minimera risken för skador på oolemma. Kassera fragmentet av zona pellucida från mikroinjektionspipetten och placera DKO-phaESC vid kanten av pipetten. Penetrera äggcellen med mikroinjektionspipetten så att oolemma når motsatt sida.OBS: Rör inte vid MII-plattan för att förhindra skador på spindeln och kromosomerna. Applicera en piezopuls (intensitet, 6; frekvens, 1) för att genomborra oolemma. Se till att oolemma slappnar av längs mikroinjection pipettens axel.OBS: Definiera empiriskt den lägsta inställningen av piezopulsen för att bryta oolemma för att minimera skadorna på äggcellen. Injicera DKO-phaESC med en minimal volym medium i ooplasm och dra ut mikroinjektionspipetten smidigt från äggcellen. Släpp den injicerade äggcellen från hållpipetten och placera den på sidan av mikrodroppen för senare insamling. Upprepa injektionsproceduren från steg 12,9 till 12, 17 för de andra MII-äggcellerna i M2-mediumfallet.OBS: Undvik att hålla äggcellerna borta från inkubatorn i mer än 20 minuter. Enligt vår erfarenhet kan ett parti på 10 äggceller manipuleras bekvämt inom 15 minuter efter lämplig träning. Överför satsen injicerade äggceller från M2 medium droppe till en förvärmd center-well maträtt med KSOM medium. Förvara skålen i 1 timme vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. Upprepa oocyte manipulation från steg 12,5 och 12,20 med ytterligare grupper av MII äggceller för att få tillräckligt injicerade äggceller. 13. Aktivering av konstruerade halvklonerade embryon Förbered två center-well rätter med 900 μL vardera av KSOM medium och aktiveringsmedium. Förbered en 4-brunnsplatta med 700 μL KSOM-medium i varje brunn. Förvärm disken och tallriken vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär. Efter 1 timme i KSOM medium, överför de injicerade äggcellerna från steg 12.21 till den förvärmda mittbrunnen med aktiveringsmedium. Förvara skålen i 6 timmar vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär för aktivering. Efter aktivering bildar observera vissa halvklonerade embryon tre polära kroppar, som är de första och andra polära kropparna i äggcellen, och den pseudopolära kroppen från DKO-phaESC (Figur 3E). Tvätta embryona 3 gånger genom att överföra dem till nya brunnar med KSOM medium i en 4-brunnsplatta. Överför embryona till mittbrunnen med KSOM medium och håll skålen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär för vidare utveckling. 14. Utveckling av konstruerade halvklonerade embryon Efter 1 kulturdag i KSOM-medium från steg 13,6 når flera halvklonerade embryon 2-cellsstadiet (Figur 5A). För vidareutveckling av embryon före implantation in vitro, fortsätt att odla de halvkloterade embryona i KSOM medium vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Överför de halvklonerade embryona till färskt KSOM-medium dag 2. Dag 4 når flera embryon blastocyststadiet ( figur5A). För härledning av halvklonerade möss, överför 2-cells embryon från steg 14,1 till äggledare av pseudo-gravida mottagare honor. Identifiera pseudogravida honor genom att para sig med vasectomiserade män en dag före embryoöverföringen och välj dem på grundval av närvaron av en tydligt synlig plugg på morgonen på dagen för embryoöverföringen (0,5 dagar efter coitum (dpc)). Omkring 19,5 dpc levereras full-term valpar naturligt från mottagarkvinnor (Figur 5B).