Tillämpa RatWalker-systemet för gånganalys i en genetisk råttmodell av Parkinsons sjukdom
Summary
Här beskriver vi RatWalker-systemet, byggt genom att omforma MouseWalker-apparaten för att tillgodose den ökade storleken och vikten hos råttor. Detta system använder frustrerad total intern reflektion (FTIR), höghastighetsvideoinspelning och analysprogramvara med öppen åtkomst för att spåra och kvantifiera gångparametrar.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som orsakas av förlusten av dopaminerga (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta. Gångavvikelser, inklusive minskad armsvängning, långsammare gånghastighet och kortare steg är vanliga hos PD-patienter och uppträder tidigt i sjukdomsförloppet. Således kommer kvantifieringen av motoriska mönster i djurmodeller av PD att vara viktig för fenotypisk karakterisering under sjukdomsförloppet och vid terapeutisk behandling. De flesta fall av PD är idiopatiska; Identifieringen av ärftliga former av PD avslöjade dock genmutationer och varianter, såsom funktionsförlustmutationer i Pink1 och Parkin, två proteiner involverade i mitokondriell kvalitetskontroll som kunde utnyttjas för att skapa djurmodeller. Medan möss är resistenta mot neurodegeneration vid förlust av Pink1 och Parkin (enkel och kombinerad deletion), hos råttor, leder Pink1 men inte Parkin-brist till nigral DA-neuronförlust och motorisk försämring. Här rapporterar vi nyttan av FTIR-avbildning för att avslöja gångförändringar hos fritt gående unga (2 månaders ålder) hanråttor med kombinerad förlust av Pink1 och Parkin före utvecklingen av grov visuellt uppenbar motorisk abnormitet när dessa råttor åldras (observerade vid 4-6 månader), kännetecknad av bakbenssläpning som tidigare rapporterats hos Pink1 knockout (KO) råttor.
Introduction
PD, den vanligaste åldersrelaterade neurodegenerativa rörelsestörningen, orsakas av förlusten av DA-neuroner i substantia nigra pars compacta. Denna förlust av nigrala DA-neuroner och DA-ingångarna i striatum leder till de observerade motoriska funktionsnedsättningarna som ses hos patienter med PD 1,2. De definierande motoriska egenskaperna hos patienter med PD, gemensamt kända som Parkinsonism, inkluderar styvhet, vilande tremor, bradykinesi, postural instabilitet och mikrografi3. Dessutom uppträder gångrubbningar, som är vanliga hos PD-patienter, tidigt i sjukdomsförloppet 1,4,5. Medan vissa livsstilar föreslås för att hjälpa till att bromsa utvecklingen av PD, såsom hälsosam kost och regelbunden motion, finns det för närvarande inget botemedel mot PD, bara mediciner för att hantera symtomen. Detta lämnar utrymme för behovet av ytterligare undersökning i hopp om förbättrad terapi. Således är karakterisering av gångmönstret i PD-djurmodeller ett avgörande verktyg för att karakterisera modellens relevans samt hur terapeutiska behandlingar som syftar till att kontrollera PD förebygger eller förbättrar motoriska funktionsnedsättningar.
Det finns olika PD-djurmodeller som har använts för att testa terapeutiska behandlingar, men var och en har sina begränsningar. Till exempel har djurmodeller behandlade med neurotoxinet 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) gett en stor mängd information om processer som är viktiga för nigral DA-neuronförlust och efterföljande striatala anpassningar och pekade på mitokondriernas roll i PD-patogenes; MPTP-modellens patogenetiska bakgrund är dock av toxisk natur snarare än en neurodegenerativ process som i human PD6. Ytterligare kemiskt inducerbara modeller inkluderar 6-hydroxidopamin (6-OHDA) och rotenon. 6-OHDA var det första medlet som användes för att inducera PD genom selektiv ackumulering av läkemedlet i DA-neuronerna, vilket så småningom dödar neuronerna och leder till PD-liknande symtom. Denna modell användes först för att spåra DA-utarmning genom att undersöka beteendet som svar på amfetamin och apomorfin7. Denna metod för PD-induktion har visat sig vara användbar för screening av farmakologiska medel som påverkar DA och dess receptorer8. Medan 6-OHDA-modellen är en bra modell för att spåra kvantifierbara motorunderskott, visar denna modell inte hur den gradvisa förlusten av neuroner och bildandet av Lewy-kroppar påverkar djuret. Den andra metoden för induktion, rotenon, har visat sig ha progressiv degeneration av nigrostriatala neuroner med förlust av tyrosinhydroxylas och DA-transportör, vilket möjliggör en bättre modell för att spåra förlust av neuroner över tid9. De rotenonbehandlade råttorna visade bradykinesi, postural instabilitet och ostadig gång10. Denna metod har dock visat sig vara mycket varierande mellan olika stammar av råttor, vilket har väckt frågan om rotenon är en pålitlig PD-modell11,12,13. Medan gånganalys har visat sig påverkas av induktion av PD hos råttor, har genetiskt inducerade PD-råttmodeller hittills inte lätt använts för gånganalys genom att fritt gå ner på en landningsbana.
Ett sätt att analysera motorisk nedsättning hos fritt gående gnagare är kinematisk gånganalys, som kan utföras genom att använda FTIR-avbildning. Denna etablerade metod använder en optisk beröringssensor baserad på FTIR, som registrerar och spårar gnagarnas fotavtryck när de rör sig nerför banan14,15,16. Jämfört med andra metoder är FTIR inte beroende av några markörer på djurets kropp som kan störa tassavtrycken. Generering av videodata ger digitala tassavtryck av alla fyra extremiteterna som kan kombineras för att skapa ett dynamiskt och reproducerbart gångmönster för olika gnagarmodeller. Principen för avbildningsbaserad gånganalys är att ta varje enskild tass och mäta kontaktytan över tid när gnagaren går nerför banan. Varje hållning representeras av en ökning av tassområdet (i bromsfasen) och en minskning av tassområdet (i framdrivningsfasen). Detta fortsätter med svängfasen, vilket är när det inte detekteras någon tasssignal. Efter utvärdering av videon genereras flera parametrar som kan användas för att jämföra vildtyp (WT) kontra PD-modell. Några exempel på parametrarna är steglängd (avstånd tassen täcker i ett steg), svängtid (varaktighet som tassen inte är i kontakt med banan), svänghastighet (steglängd som en funktion av svängvaraktighet) och stegmönster (diagonala steg, sidosteg eller gördelsteg).
För att demonstrera nyttan av FTIR för att avslöja tidiga gångmönsterförändringar hos råttor använde vi en genetisk råttmodell av PD. Medan de flesta fall av PD är idiopatiska; identifieringen av ärftliga former av PD avslöjade genmutationer och varianter, såsom funktionsförlustmutationer i Pink1 och Parkin, två proteiner involverade i mitokondriell kvalitetskontroll17, som kunde utnyttjas för att skapa djurmodeller18. Tyvärr är möss resistenta mot neurodegeneration vid förlust av dessa proteiner (enstaka och kombinerade)19,20,21. Hos råttor leder Pink1 men inte Parkin-brist till nigral DA-neuronförlust och motoriska funktionsnedsättningar22, men utan fullständig penetrans. Därför genererade vi en kombinerad Pink1 / Parkin dubbel knockout (DKO) råttmodell, som visar den uppenbara visuellt uppenbara bakbensdragande fenotypen som rapporterats hos manliga Pink1 KO-råttor22 men nu i högre takt: 100% mot 30-50% av hanarna mellan 4-6 månader.
Medan denna metod fungerar bra för att analysera motorunderskott hos möss14, var FTIR-bildgångsystemspecifikationer för att rymma råttans storlek och vikt tidigare inte tillgängliga icke-kommersiellt. Här förklarar vi hur man bygger RatWalker, ett modifierat FTIR gångbildningssystem modellerat efter MouseWalker14, förutom anpassat för råttornas storlek och vikt. Detta system använder en optisk effekt, FTIR, för att tillhandahålla en metod för att visualisera och därefter registrera djuravtryck för analys. Kontakt mellan ett djurs fot och den optiska vågledaren (plattformen) orsakar störningar i ljusvägen vilket resulterar i en synlig spridningseffekt, som fångas med hjälp av inhemsk kvalitet, höghastighetsvideografi och bearbetning med öppen källkod. Denna studie visar kraften i FTIR-avbildning för att studera gångförändringar i genetiska råttmodeller av PD. Till exempel, medan uppenbara visuellt uppenbara motoriska förändringar (dvs. bakbenssläpning) observeras hos manliga DKO-råttor tidigast vid 4 månader, kan vi med hjälp av FTIR avslöja grindavvikelser hos manliga DKO-råttor vid 2 månaders ålder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gångstörningar, inklusive minskad armsvängning, långsammare gånghastighet och kortare steg, är ett definierande drag hos PD och uppträder tidigt under sjukdomsförlopp 1,5. Flera metoder har utvecklats under åren för att observera och registrera fotfall för gånganalys i gnagarmodeller av PD, med manuella tekniker för kvantifiering av fotfallsposition som leder till automatiserade tillvägagångssätt som är känsligare och kan fånga dynamiska parame…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS och HF tackar Michael J Fox Foundation for Parkinson’s Research för stöd till deras arbete med Parkinsons sjukdom.
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson’s disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson’s disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson’s disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson’s Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neurosciences. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson’s disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson’s disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson’s disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
