Gonadectomie en bloedafname procedures in het kleine formaat Teleost Model Japanse Medaka(Oryzias latipes)
Summary
Het artikel beschrijft een snel protocol om bloed van de kleine teleostvis te gonadectomiseren en te bemonsteren, met behulp van Japanse medaka (Oryzias latipes) als model, om de rol van geslachtssteroïden in de dierfysiologie te onderzoeken.
Abstract
Geslachtssteroïden, geproduceerd door de geslachtsdelen, spelen een essentiële rol in de plasticiteit van hersenen en hypofyseweefsel en in de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij alle gewervelde dieren door feedback te geven aan de hersenen en hypofyse. Teleostvissen bezitten een hogere mate van weefselplasticiteit en variatie in voortplantingsstrategieën in vergelijking met zoogdieren en lijken nuttige modellen te zijn om de rol van geslachtssteroïden en de mechanismen waarmee ze werken te onderzoeken. De verwijdering van de belangrijkste bron van de productie van geslachtssteroïden met behulp van gonadectomie samen met bloedafname om steroïde niveaus te meten, is goed ingeburgerd en redelijk haalbaar bij grotere vissen en is een krachtige techniek om de rol en effecten van geslachtssteroïden te onderzoeken. Deze technieken brengen echter uitdagingen met zich mee wanneer ze worden geïmplementeerd in kleine teleostmodellen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures van gonadectomie bij zowel mannelijke als vrouwelijke Japanse medaka gevolgd door bloedafname. Deze protocollen blijken zeer haalbaar te zijn in medaka, aangegeven door een hoge overlevingskans, veiligheid voor de levensduur en het fenotype van de vis en reproduceerbaarheid in termen van klaring van geslachtssteroïden. Het gebruik van deze procedures in combinatie met de andere voordelen van het gebruik van dit kleine teleost-model zal het begrip van feedbackmechanismen in de neuro-endocriene controle van reproductie en weefselplasticiteit door geslachtssteroïden bij gewervelde dieren aanzienlijk verbeteren.
Introduction
Bij gewervelde dieren spelen geslachtssteroïden, die voornamelijk worden geproduceerd door de geslachtsnaden, een belangrijke rol bij de regulatie van de Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) -as via verschillende feedbackmechanismen1,2,3,4,5. Bovendien beïnvloeden geslachtssteroïden de proliferatie en activiteit van neuronen in de hersenen6,7,8 en endocriene cellen, waaronder gonadotropen, in de hypofyse9,10, en dienen dus cruciale rollen in de hersenen en hypofyse plasticiteit. Ondanks relatief goede kennis bij zoogdieren, is het mechanisme van BPG-asregulatie gemedieerd door geslachtssteroïden verre van begrepen bij niet-zoogdiersoorten, wat leidt tot een slecht begrip van evolutionaire geconserveerde principes11. Er is nog steeds een beperkt aantal studies die de rol van geslachtssteroïden op de hersenen en hypofyseplasticiteit documenteren, waardoor de behoefte aan verder onderzoek naar de rol en effecten van geslachtssteroïden op verschillende gewervelde soorten toeneemt.
Onder gewervelde dieren zijn teleosten krachtige modeldieren geworden bij het aanpakken van tal van biologische en fysiologische vragen, waaronder stressrespons12,13,groei14,15,voedingsfysiologie16,17 en reproductie2. Teleosts, waarin geslachtssteroïden meestal worden vertegenwoordigd door estradiol (E2) bij vrouwen en 11-ketotestosteron (11-KT) bij mannen18,19, zijn al lang betrouwbare experimentele modellen voor het onderzoeken van het algemene principe van reproductie tussen soorten. Teleosts vertonen uniciteit in hun hypothalamus-hypofyseverbinding20,21 en verschillende gonadotroopcellen22, die soms handig zijn voor de opheldering van regulerende mechanismen. Bovendien bieden teleosts vanwege hun vatbaarheid voor zowel laboratorium- als veldexperimenten veel voordelen in vergelijking met andere organismen. Ze zijn relatief goedkoop in aanschaf en onderhoud23,24. Met name kleine teleostmodellen zoals zebravissen(Danio rerio)en de Japanse medaka(Oryzias latipes),zijn soorten met een zeer hoge vruchtbaarheid en een relatief korte levenscyclus die een snelle analyse van genfunctie en ziektemechanismen mogelijk maken23, waardoor nog grotere voordelen worden geboden bij het aanpakken van een overvloed aan biologische en fysiologische vragen, gezien de vele goed ontwikkelde protocollen en genetische toolkit die beschikbaar zijn voor deze soorten25.
In talrijke studies is de verwijdering van geslachtsdia (gonadectomie) samen met bloedafnametechnieken gebruikt als een methode voor het onderzoeken van vele fysiologische vragen, waaronder de impact ervan op de voortplantingsfysiologie van gewervelde dieren bij zoogdieren26,27,28,vogels29 en amfibieën30. Hoewel het gonadectomie-effect op de voortplantingsfysiologie alternatief kan worden nagebootst door geslachtssteroïdantagonisten, zoals tamoxifen en clomifeen, lijkt het effect van de geneesmiddelen inconsistent te zijn vanwege bimodale effecten31,32. Chronische blootstelling aan een geslachtssteroïdantagonist kan leiden tot ovariëlevergroting 33,34, die de observatie van de effecten ervan voor langetermijndoeleinden kan uitschakelen als gevolg van een ongezond fenotype. Bovendien is het onmogelijk om een herstelexperiment uit te voeren na behandeling met geslachtssteroïdantagonisten, om het specifieke effect van bepaalde geslachtssteroïden te rechtvaardigen. Samen met die bovengenoemde punten, andere trade-offs van geslacht steroïde antagonist gebruik zijn uitgebreid beoordeeld31,32. Daarom verschijnt gonadectomie vandaag de dag nog steeds als een krachtige techniek om de rol van geslachtssteroïden te onderzoeken.
Hoewel gonadectomie en bloedafnametechnieken relatief eenvoudig uit te voeren zijn bij grotere soorten, zoals Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax)35, blauwkoplipvis (Thalassoma bifasciatum)36, hondshaai (Scyliorhinus canicula)37 en meerval (Heteropneustes fossilis en Clarias bathracus)38,39, roepen ze uitdagingen op wanneer ze worden toegepast in kleine vissen als medaka. Het gebruik van Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 is bijvoorbeeld minder haalbaar en lijkt gevoelig te zijn voor overmatige fysieke schade voor kleine vissen. Bovendien is een gonadectomieprocedure die vaak wordt gebruikt voor grotere vissen40 niet geschikt voor kleine vissen die een hoge precisie vereisen om overmatige schade te voorkomen. Ten slotte is bloedafname een uitdaging vanwege de beperkte toegang tot bloedvaten en de kleine hoeveelheid bloed bij die dieren. Daarom is een duidelijk protocol dat elke stap van gonadectomie en bloedafname in een kleine teleost demonstreert van belang.
Dit protocol demonstreert de stapsgewijze procedures van gonadectomie gevolgd door bloedafname in Japanse medaka, een kleine zoetwatervis afkomstig uit Oost-Azië. Japanse medaka hebben een gesequenced genoom, verschillende moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25, en een genetisch geslachtsbepalingssysteem dat onderzoek naar seksuele verschillen mogelijk maakt voordat secundaire geslachtskenmerken of geslachtsvolgen goed ontwikkeld zijn41. Interessant is dat Japanse medaka gefuseerde gonaden bezitten in tegenstelling tot veel andere teleostsoorten42. Deze twee technieken gecombineerd duren in totaal slechts 8 minuten en zullen de lijst met videoprotocollen die al voor deze soort bestaan, compleet maken, waaronder etikettering van bloedvaten43,patch-clamp op hypofysesecties44 en hersenneuronen45en primaire celcultuur46. Deze technieken zullen de onderzoeksgemeenschap in staat stellen om de rollen van geslachtssteroïden in feedbackmechanismen en hersen- en hypofyseplasticiteit in de toekomst te onderzoeken en beter te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals gemeld in eerdere literatuur, zijn gonadectomie en bloedafname al lang gebruikt in andere modelsoorten om vragen te onderzoeken met betrekking tot de rol van geslachtssteroïden in de regulatie van de BPG-as. Deze technieken lijken echter alleen geschikt te zijn voor grotere dieren. Gezien de kleine omvang van het veelgebruikte teleostmodel, Japanse medaka, bieden we een gedetailleerd protocol voor gonadectomie en bloedafname dat haalbaar is voor deze soort.
Het feit dat de overlevingska…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor haar hulp in de visteelt. Dit werk werd gefinancierd door NMBU, Grants-in-Aid van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant nummer 18H04881 en 18K19323), en subsidie voor Basic Science Research Projects van Sumitomo Foundation naar S.K.
Materials
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | – | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -. A., Andersson, E., Andersen, &. #. 2. 1. 6. ;., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B., Farrell, A. P. . Encyclopedia of Fish Physiology. 2, 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -. A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
- Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
- Weltzien, F. -. A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones – Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
- Naruse, K., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y., Murata, K., et al. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. 2, 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
