Het artikel beschrijft een snel protocol om bloed van de kleine teleostvis te gonadectomiseren en te bemonsteren, met behulp van Japanse medaka (Oryzias latipes) als model, om de rol van geslachtssteroïden in de dierfysiologie te onderzoeken.
Geslachtssteroïden, geproduceerd door de geslachtsdelen, spelen een essentiële rol in de plasticiteit van hersenen en hypofyseweefsel en in de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij alle gewervelde dieren door feedback te geven aan de hersenen en hypofyse. Teleostvissen bezitten een hogere mate van weefselplasticiteit en variatie in voortplantingsstrategieën in vergelijking met zoogdieren en lijken nuttige modellen te zijn om de rol van geslachtssteroïden en de mechanismen waarmee ze werken te onderzoeken. De verwijdering van de belangrijkste bron van de productie van geslachtssteroïden met behulp van gonadectomie samen met bloedafname om steroïde niveaus te meten, is goed ingeburgerd en redelijk haalbaar bij grotere vissen en is een krachtige techniek om de rol en effecten van geslachtssteroïden te onderzoeken. Deze technieken brengen echter uitdagingen met zich mee wanneer ze worden geïmplementeerd in kleine teleostmodellen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures van gonadectomie bij zowel mannelijke als vrouwelijke Japanse medaka gevolgd door bloedafname. Deze protocollen blijken zeer haalbaar te zijn in medaka, aangegeven door een hoge overlevingskans, veiligheid voor de levensduur en het fenotype van de vis en reproduceerbaarheid in termen van klaring van geslachtssteroïden. Het gebruik van deze procedures in combinatie met de andere voordelen van het gebruik van dit kleine teleost-model zal het begrip van feedbackmechanismen in de neuro-endocriene controle van reproductie en weefselplasticiteit door geslachtssteroïden bij gewervelde dieren aanzienlijk verbeteren.
Bij gewervelde dieren spelen geslachtssteroïden, die voornamelijk worden geproduceerd door de geslachtsnaden, een belangrijke rol bij de regulatie van de Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) -as via verschillende feedbackmechanismen1,2,3,4,5. Bovendien beïnvloeden geslachtssteroïden de proliferatie en activiteit van neuronen in de hersenen6,7,8 en endocriene cellen, waaronder gonadotropen, in de hypofyse9,10, en dienen dus cruciale rollen in de hersenen en hypofyse plasticiteit. Ondanks relatief goede kennis bij zoogdieren, is het mechanisme van BPG-asregulatie gemedieerd door geslachtssteroïden verre van begrepen bij niet-zoogdiersoorten, wat leidt tot een slecht begrip van evolutionaire geconserveerde principes11. Er is nog steeds een beperkt aantal studies die de rol van geslachtssteroïden op de hersenen en hypofyseplasticiteit documenteren, waardoor de behoefte aan verder onderzoek naar de rol en effecten van geslachtssteroïden op verschillende gewervelde soorten toeneemt.
Onder gewervelde dieren zijn teleosten krachtige modeldieren geworden bij het aanpakken van tal van biologische en fysiologische vragen, waaronder stressrespons12,13,groei14,15,voedingsfysiologie16,17 en reproductie2. Teleosts, waarin geslachtssteroïden meestal worden vertegenwoordigd door estradiol (E2) bij vrouwen en 11-ketotestosteron (11-KT) bij mannen18,19, zijn al lang betrouwbare experimentele modellen voor het onderzoeken van het algemene principe van reproductie tussen soorten. Teleosts vertonen uniciteit in hun hypothalamus-hypofyseverbinding20,21 en verschillende gonadotroopcellen22, die soms handig zijn voor de opheldering van regulerende mechanismen. Bovendien bieden teleosts vanwege hun vatbaarheid voor zowel laboratorium- als veldexperimenten veel voordelen in vergelijking met andere organismen. Ze zijn relatief goedkoop in aanschaf en onderhoud23,24. Met name kleine teleostmodellen zoals zebravissen(Danio rerio)en de Japanse medaka(Oryzias latipes),zijn soorten met een zeer hoge vruchtbaarheid en een relatief korte levenscyclus die een snelle analyse van genfunctie en ziektemechanismen mogelijk maken23, waardoor nog grotere voordelen worden geboden bij het aanpakken van een overvloed aan biologische en fysiologische vragen, gezien de vele goed ontwikkelde protocollen en genetische toolkit die beschikbaar zijn voor deze soorten25.
In talrijke studies is de verwijdering van geslachtsdia (gonadectomie) samen met bloedafnametechnieken gebruikt als een methode voor het onderzoeken van vele fysiologische vragen, waaronder de impact ervan op de voortplantingsfysiologie van gewervelde dieren bij zoogdieren26,27,28,vogels29 en amfibieën30. Hoewel het gonadectomie-effect op de voortplantingsfysiologie alternatief kan worden nagebootst door geslachtssteroïdantagonisten, zoals tamoxifen en clomifeen, lijkt het effect van de geneesmiddelen inconsistent te zijn vanwege bimodale effecten31,32. Chronische blootstelling aan een geslachtssteroïdantagonist kan leiden tot ovariëlevergroting 33,34, die de observatie van de effecten ervan voor langetermijndoeleinden kan uitschakelen als gevolg van een ongezond fenotype. Bovendien is het onmogelijk om een herstelexperiment uit te voeren na behandeling met geslachtssteroïdantagonisten, om het specifieke effect van bepaalde geslachtssteroïden te rechtvaardigen. Samen met die bovengenoemde punten, andere trade-offs van geslacht steroïde antagonist gebruik zijn uitgebreid beoordeeld31,32. Daarom verschijnt gonadectomie vandaag de dag nog steeds als een krachtige techniek om de rol van geslachtssteroïden te onderzoeken.
Hoewel gonadectomie en bloedafnametechnieken relatief eenvoudig uit te voeren zijn bij grotere soorten, zoals Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax)35, blauwkoplipvis (Thalassoma bifasciatum)36, hondshaai (Scyliorhinus canicula)37 en meerval (Heteropneustes fossilis en Clarias bathracus)38,39, roepen ze uitdagingen op wanneer ze worden toegepast in kleine vissen als medaka. Het gebruik van Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 is bijvoorbeeld minder haalbaar en lijkt gevoelig te zijn voor overmatige fysieke schade voor kleine vissen. Bovendien is een gonadectomieprocedure die vaak wordt gebruikt voor grotere vissen40 niet geschikt voor kleine vissen die een hoge precisie vereisen om overmatige schade te voorkomen. Ten slotte is bloedafname een uitdaging vanwege de beperkte toegang tot bloedvaten en de kleine hoeveelheid bloed bij die dieren. Daarom is een duidelijk protocol dat elke stap van gonadectomie en bloedafname in een kleine teleost demonstreert van belang.
Dit protocol demonstreert de stapsgewijze procedures van gonadectomie gevolgd door bloedafname in Japanse medaka, een kleine zoetwatervis afkomstig uit Oost-Azië. Japanse medaka hebben een gesequenced genoom, verschillende moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25, en een genetisch geslachtsbepalingssysteem dat onderzoek naar seksuele verschillen mogelijk maakt voordat secundaire geslachtskenmerken of geslachtsvolgen goed ontwikkeld zijn41. Interessant is dat Japanse medaka gefuseerde gonaden bezitten in tegenstelling tot veel andere teleostsoorten42. Deze twee technieken gecombineerd duren in totaal slechts 8 minuten en zullen de lijst met videoprotocollen die al voor deze soort bestaan, compleet maken, waaronder etikettering van bloedvaten43,patch-clamp op hypofysesecties44 en hersenneuronen45en primaire celcultuur46. Deze technieken zullen de onderzoeksgemeenschap in staat stellen om de rollen van geslachtssteroïden in feedbackmechanismen en hersen- en hypofyseplasticiteit in de toekomst te onderzoeken en beter te begrijpen.
Zoals gemeld in eerdere literatuur, zijn gonadectomie en bloedafname al lang gebruikt in andere modelsoorten om vragen te onderzoeken met betrekking tot de rol van geslachtssteroïden in de regulatie van de BPG-as. Deze technieken lijken echter alleen geschikt te zijn voor grotere dieren. Gezien de kleine omvang van het veelgebruikte teleostmodel, Japanse medaka, bieden we een gedetailleerd protocol voor gonadectomie en bloedafname dat haalbaar is voor deze soort.
Het feit dat de overlevingska…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor haar hulp in de visteelt. Dit werk werd gefinancierd door NMBU, Grants-in-Aid van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant nummer 18H04881 en 18K19323), en subsidie voor Basic Science Research Projects van Sumitomo Foundation naar S.K.
Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
Razor blade | – | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |