Målet med denne protokol er at give detaljeret vejledning om prøveforberedelsen, når der planlægges forsøg med MALDI MSI for at maksimere metabolisk og molekylær detektion i biologiske prøver.
Metabolomics, undersøgelsen for at identificere og kvantificere små molekyler og metabolitter, der er til stede i en eksperimentel prøve, har vist sig som et vigtigt redskab til at undersøge de biologiske aktiviteter under udvikling og sygdomme. Metabolomics tilgange er almindeligt anvendt i studiet af kræft, ernæring / kost, diabetes, og andre fysiologiske og patologiske forhold, der involverer metaboliske processer. Et fordelagtigt værktøj, der hjælper med metabolomisk profilering, der anbefales i dette papir, er matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse (MALDI MSI). Dens evne til at opdage metabolitter in situ uden mærkning, strukturelle modifikationer eller andre specialiserede reagenser, såsom dem, der anvendes til immunstaining, gør MALDI MSI til et unikt værktøj til at fremme metoder, der er relevante inden for metabolomics. En passende prøveforberedelsesproces er afgørende for at give optimale resultater og vil være i fokus i dette papir.
Metabolitter, mellemprodukter eller slutprodukter af stofskiftet, herunder nukleotider, aminosyrer eller organiske syrer, lipider, er nøglekomponenter til biologiske funktioner og processer. Metabolomics, studiet af metabolitter, giver mulighed for udforskning af deres biokemiske interaktioner og forståelsen af deres roller i forbindelse med grundlæggende, translationel og klinisk forskning. Metabolitter er stærkt forbundet med fænotyper af organismer og give oplysninger om biokemiske aktiviteter, der opstår under cellulær metabolisme1. Ud over genomforskning og proteomics har metabolomics derfor vist sig som et vigtigt redskab til at forstå både fysiologiske og patologiske forhold. For eksempel anvendes metabolomics til at belyse mekanismerne bag eksisterende lægemidler samt deres tolerance. I lægemiddeludvikling er xenobiotisk metabolisme nyttig til vurdering af metabolitternes aktivitet eller toksicitet på tværs af arter, hvilket senere kan oversættes til at understøtte personlig medicin2. På trods af den brede anvendelse af metabolomics kan billeddannelse af metabolitter være udfordrende på grund af metabolitternes kemiske reaktivitet, strukturel heterogenitet og bredt koncentrationsområde3. Men koncentrationerne af labile metabolitter, herunder højenergiforbindelser, glukose, laktat, glykolytisk, pentose shunt vej, og TCA cyklus mellemprodukter, fosfolipider, neurotransmittere, signalering forbindelser, kan ændre sig inden for få sekunder og fremskridt over minutter, når væv enzymer er aktive under væv høst procedurer, såsom postmortem iskæmi i hjernen høst4,5,6 . For at sikre nøjagtig erhvervelse af metabolomics-data er passende og omhyggelig prøveforberedelse afgørende7,8. Nuværende etablerede platforme til måling af metabolitter omfatter NMR, enzymanalyser og massespektrometri (herunder flydende og gaskromatografi), hvoraf den sidste diskuteres yderligere nedenfor.
MALDI-MSI er en state-of-the-art teknik, der giver mulighed for analyse af komplekse prøver gennem påvisning af individuelle molekylære arter. MALDI MSI giver fordelen ved hurtigt og reproducerligt at kunne måle forskellige molekylære forbindelser i biologiske prøver. Massespektrometribilleddannelse giver yderligere mulighed for produktion af billeder, der repræsenterer vævsbiologi baseret på dets sammensatte metabolitter, og gør det samtidig med at metabolitternes rumlige fordeling bevares i prøve9. MALDI’s evne til at detektere analytter i en prøve uden brug af antistofmærkning, strukturelle modifikationer eller andre specialiserede reagenser, såsom dem, der anvendes til immunstainning, kombineret med dets evne til at overvåge hundredvis af molekyler inden for et enkelt eksperiment omfatter blot nogle få af de fordele, MS-billeddannelse giver, når det kommer til metabolisk profilering10, 11. Ud over almindeligt anvendt matrix såsom 2,5-dihydroxybenzosyre (DHB) og 9-aminoacridin (9-AA), nyligt opdaget nye matrix N -(1-Naphthyl) Ethylenediamin Dihydrochlorid (NEDC), som er velegnet til analyser af forskellige lav molekylvægt metabolitter, har yderligere forbedret anvendelsen af MALDI MSI i metabolisk profilering12.
På trods af den brede anvendelse af MALDI MSI forhindrer de høje omkostninger ved instrumentet og forsøgsprocedurens kompleksitet dens bredere gennemførelse i de enkelte forskningslaboratorier. Derfor understøttes de fleste af MALDI MSI-undersøgelserne gennem fælles kernefaciliteter. Prøveforberedelsen, herunder slideforberedelse og matrixbelægning, er det mest kritiske trin i MALDI MSI. Diaspræparatet udføres dog normalt i den enkelte forskers laboratorium, hvilket skaber potentielle variationer i senere MALDI MSI-erhvervelse. Her sigter vi mod at levere en detaljeret protokol til prøvepræparat af biologiske prøver, før vi går videre til MALDI MSI-målinger, og bruge en metabolomisk profilering af udviklingsmushjerne som et eksempel.
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) er en etiketfri billedteknik, der gør det muligt for forskere at undersøge fordelingen af forskellige biomolekyler og deres modifikationer i væv, det molekylære grundlag for patologi. Kombineret brug af MALDI-MSI med traditionelle LC-MS-tilgange til vævsanalyse giver samme molekylære dybde som traditionelle Omics-arbejdsgange, men som også bevarer det rumlige forhold mellem disse signaler inden for mobilnetværket. Prøveforberedelsen er det mest kritiske trin i MALDI MSI og tegner sig for variationen i de endelige udlæsninger af metabolomics-undersøgelser udført i forskellige laboratorier4. Her leverer vi en omfattende, men praktisk protokol til standardisering af prøveforberedelsen til metabolomisk profilering ved hjælp af MALDI MSI i håb om, at det gavner et bredt forskningsmiljø at implementere MALDI MSI i deres nuværende og fremtidige forskning fra grundlæggende biologi til translationelle undersøgelser.
Man skal altid huske på alle forholdsregler for at minimere ændringer i molekylære profiler (både overflod og rumlig fordeling) under prøvepræparater og undgå forurening. For det første minimere tiden mellem animalsk aktiv dødshjælp og væv høst, såsom frosset in situ eller opvarmet ved mikrobølge fiksering til at inaktivere enzymer i hjernen for at reducere ansvaret for postmortem iskæmi4,5,6. For det andet er prøvens snapfrysningstilstand kritisk. Utilstrækkelig frysning vil forårsage nedbrydning og tab af metabolitterne, mens over frysning vil føre til vævsfragmentering under kryosektion. Frysetiden bør altid testes først i henhold til tidligere rapporterede undersøgelser, og studiet af udviklingsmushjernen, der præsenteres i dette papir, giver referencepunkterne for gnaverhjernevæv. For det tredje vil skæring af biologisk væv og overførsel af deres sektioner til ITO-dias kræve tilstrækkelig praksis. Det er vigtigt at bemærke, at mens du bruger børsten til at afhente sektionen fra scenen, skal børsten bruges delikat. Lad børstebørster kun komme i kontakt med kanterne af vævssektionen for at mindske risikoen for forurening og sektionsfragmentering. Samkopier afsnittet på diaset så meget som muligt, dette vil forhindre curling af sektionen under finger-opvarmning. For det fjerde, mens montering på ITO dias, sørg for hele afsnittet er godt knyttet til ITO dias som forskellige regioner i vævet kan kræve forskellige tid af finger-opvarmning. For eksempel kræver hjernetumorvæv længere opvarmningstid end normalt hjernevæv. En dårlig montering kan føre til løsrivelse og fragmentering af vævet under MALDI-MS scanning. Husk på, at finger opvarmning kan muliggøre enzym handling og stofskifte forårsager artifactual ændringer af metabolitter. For det femte spiller en fin og ensartet aflejring af MALDI-matrixen en vigtig rolle med hensyn til at opnå nøjagtig geografisk information og et stærkt MALDI-MS-signal. Det anbefales at teste matrixsprøjtningen på et tomt dias og observere krystalmønsteret under et mikroskop for at kontrollere korrekt dækning, før du fortsætter til belægningen af dyrebar prøvedias. Og endelig, da en individuel forsker udfører væv høst og slide forberedelse ved forskellige hastigheder, ville det være ideelt at have en person til at håndtere prøven forberedelse til prøven i samme kohorte, for at minimere variationen.
Protokollen ovenfor beskriver standardprocedurer, som kan skræddersys til behovene i forbindelse med bestemte eksperimenter. For eksempel kan en kryo-sektionsgel OCT, som normalt bruges i kryosektion af prøven, yderligere anvendes som en monteringslim til vævspatronen (som i den ovenfor beskrevne undersøgelse). Tidligere undersøgelser har vist, at polymerkomponenten i OCT forårsager stærk ionundertrykkelse14. Indlejring af prøven kan dog være uundgåelig i de tilfælde, hvor vævet er for skrøbeligt til at blive skåret uden yderligere støtte fra en polymergel. For at bekæmpe signalundertrykkelse i disse tilfælde kan det være nødvendigt at vaske vævene med seriel vask i 70% ethanol og 95% ethanol for at fjerne resterende OLT til påvisning af proteiner eller lipider, mens vask ikke anbefales til påvisning af små molekylære metabolitter9.
MALDI MSI er blevet mere og mere relevant i både forskningslaboratoriet og klinisk praksis. For eksempel har MALDI MSI for nylig vist sig nyttig i undersøgelser af proteomics for at karakterisere den fænotypiske funktionelle status for en organisme15, og i at fungere som et middel til mikrobiel identifikation og diagnose af efterfølgende sygdom16. Mens MALDI MSI understøtter en bred vifte af applikationer, er der nogle begrænsninger forbundet med udelukkende at stole på denne teknik, især når det kommer til at skelne mellem lignende arter eller metabolitter og identifikation af specifikke mål. En anden udfordring er kvantificeringen af metabolitternes koncentration i henhold til MALDI MSI-signaler. Det antages ofte, at ion overflod i MALDI MSI spektre og den rumlige fordeling (eller relative overflod) af tilsvarende molekylære arter på tværs af dissekerede væv er godt korreleret. Man skal dog altid huske på, at forholdet mellem ionintensitet og mængden af tilsvarende molekylære arter kompliceres af mange faktorer, herunder, men ikke begrænset til, virkninger af ionundertrykkelse, ændringer i vævsstruktur og ionmolekylereaktioner17. Teknikker, der gør brug af interne standarder, kan implementeres til absolut kvantificering (μmol/g væv) i MALDI-MSI18. Disse to udfordringer håndteres typisk med den kombinerede arbejdsgang for MALDI MSI med flydende kromatografi tandem MS(LC-MS/MS) teknikker, hvorved MALDI-MS giver mulighed for kortlægning af interesseområdet, som senere udsættes for mikroextraction og LC-MS/MS for at give flere oplysninger til identifikation af metabolit19.
MS-baserede billeddannelsesmetoder er blevet udviklet i de senere år som en alternativ modalitet til tidligere teknikker til billeddannelse af små molekyle metabolitter. Med fremskridt og stigende popularitet af MALDI MSI forventes det, at MALDI-billeddannelse bliver et nyt standardværktøj til visualisering af små molekyler. Billeddannelse af lipid og endogene små molekyler (f.eks. neurotransmittere og metabolitter) i biologisk sammenhæng samt billeddannelse af xenobiotika til udvikling af nye lægemidler er af særlig interesse. Disse tre områder forventes at have hurtige fremskridt med anvendelsen af MALDI MSI i den nærmeste fremtid20.
The authors have nothing to disclose.
Ye He og Rinat Abzalimov støttes af Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen og Kelly Veerasammy er støttet af Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |