Målet med detta protokoll är att ge detaljerad vägledning om provberedningen när man planerar för experiment med MALDI MSI för att maximera metabolisk och molekylär detektion i biologiska prover.
Metabolomik, studien för att identifiera och kvantifiera små molekyler och metaboliter som finns i ett experimentellt prov, har dykt upp som ett viktigt verktyg för att undersöka de biologiska aktiviteterna under utveckling och sjukdomar. Metabolomikmetoder används i stor utsträckning i studien av cancer, näring/kost, diabetes och andra fysiologiska och patologiska tillstånd som involverar metaboliska processer. Ett fördelaktigt verktyg som hjälper till med metabolomisk profilering som förespråkas i detta dokument är matrisassisterad laserdesorption/joniseringsmasspektrometriavbildning (MALDI MSI). Dess förmåga att upptäcka metaboliter på plats utan märkning, strukturella modifieringar eller andra specialiserade reagenser, såsom de som används vid immunstainering, gör MALDI MSI till ett unikt verktyg för att främja metoder som är relevanta inom metabolomik. En lämplig provberedningsprocess är avgörande för att ge optimala resultat och kommer att vara i fokus för detta dokument.
Metaboliter, intermediärer eller slutprodukter från metabolismen, inklusive nukleotider, aminosyror eller organiska syror, lipider, är nyckelkomponenter till biologiska funktioner och processer. Metabolomik, studien av metaboliter, möjliggör utforskning av deras biokemiska interaktioner och förståelsen av deras roller i samband med grundläggande, translationell och klinisk forskning. Metaboliter är starkt förknippade med fenotyper av organismer och ger information om biokemiska aktiviteter som uppstår under cellulär metabolism1. Därför, förutom genomik och proteomik, har metabolomik dykt upp som ett viktigt verktyg för att förstå både fysiologiska och patologiska förhållanden. Till exempel används metabolomik för att belysa mekanismerna bakom befintliga läkemedel samt deras tolerans. I läkemedelsutveckling är xenobiotisk metabolism användbar för att bedöma aktiviteten eller toxiciteten hos metaboliter över arter, vilket senare innebär att stödja personlig medicin2. Trots den breda tillämpningen av metabolomik kan avbildning av metaboliter vara utmanande på grund av metaboliters kemiska reaktivitet, strukturell heterogenitet och brett koncentrationsområde3. Koncentrationerna av labila metaboliter inklusive högenergiföreningar, glukos, laktat, glykolytisk, pentoshuntväg och TCA-cykel intermediärer, fosfolipider, signalsubstanser, signalföreningar, kan dock förändras inom någrasekunderoch utvecklas över minuter när vävnadsenzymer är aktiva under vävnadsskördsförfaranden, såsom postmortem ischemi vidhjärnskörd 4,5,6 . För att säkerställa korrekt metabolomikdatainsamling är lämplig och noggrann provberedning kritisk7,8. Nuvarande etablerade plattformar för mätning av metaboliter inkluderar NMR, enzymanalyser och masspektrometri (inklusive vätske- och gaskromatografi), varav den sista diskuteras vidare nedan.
MALDI-MSI är en toppmodern teknik som möjliggör analys av komplexa prover genom detektion av enskilda molekylära arter. MALDI MSI ger fördelen av att snabbt och reproducerbart kunna mäta olika molekylära föreningar i biologiska prover. Masspektrometriavbildning möjliggör vidare produktion av bilder som representerar vävnadsbiologi baserat på dess sammansatta metaboliter, och gör det samtidigt som den rumsliga fördelningen av metaboliterna iprovet 9bevaras. Maldis förmåga att upptäcka analyter i ett prov utan användning av antikroppsmärkning, strukturella modifieringar eller andra specialiserade reagenser, såsom de som används vid immunostaining, i kombination med dess förmåga att övervaka hundratals molekyler inom ett enda experiment, utgör bara några av de fördelar som MS imaging ger när det gäller metabolisk profilering10, 11. I artikel 11 i eu 2. Förutom vanlig matris som 2,5-dihydroxybensosyra (DHB) och 9-aminoacridine (9-AA), nyligen upptäckt ny matris N -(1-Naphthyl) Etylendiamin Dihydrochloride (NEDC), som är väl lämpad för analyser av olika låg molekylvikt metaboliter, har ytterligare förbättrat tillämpningen av MALDI MSI vid metabolisk profilering12.
Trots den breda tillämpningen av MALDI MSI förhindrar instrumentets höga kostnader och komplexiteten i försöksförfarandet dess bredare genomförande i enskilda forskningslaboratorier. Därför stöds de flesta av MALDI MSI-studierna genom gemensamma kärnfaciliteter. Provberedningen, inklusive glidberedning och matrisbeläggning, är det mest kritiska steget i MALDI MSI. Glidpreparatet utförs dock normalt i enskilda forskares laboratorium, vilket skapar potentiella variationer i senare MALDI MSI-förvärv. Här strävar vi efter att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för provberedning av biologiska prover innan vi fortsätter till MALDI MSI-mätningar och använda en metabolomisk profilering av utvecklingsmushjärnan som exempel.
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) är en etikettfri bildteknik som gör det möjligt för forskare att undersöka fördelningen av olika biomolekyler och deras modifieringar i vävnad, patologins molekylära grund. Kombinerad användning av MALDI-MSI med traditionella LC-MS-metoder för vävnadsanalys ger samma molekylära djup som traditionella Omics-arbetsflöden men som också behåller det rumsliga förhållandet mellan dessa signaler inom mobilnätet. Provberedningen är det mest kritiska steget i MALDI MSI och står för variationen i de slutliga avläsningarna av metabolomikstudier som utförs i olikalaboratorier 4. Här tillhandahåller vi ett omfattande men praktiskt protokoll för att standardisera provberedningen för metabolomisk profilering med hjälp av MALDI MSI, i hopp om att det gynnar ett brett forskarsamhälle att implementera MALDI MSI i sin nuvarande och framtida forskning från grundbiologi till translationella studier.
Man måste alltid komma ihåg alla försiktighetsåtgärder för att minimera förändringar i molekylära profiler (både överflöd och rumslig fördelning) under provberedningar och undvika kontaminering. För det första, minimera tiden mellan djurdödshjälp och vävnadsskörd, såsom frusen på plats eller uppvärmd av mikrovågsfixering för att inaktivera enzymer i hjärnan för att minska ansvaret för postmortem ischemi4,5,6. För det andra är provet är avgörande. Otillräcklig frysning kommer att orsaka nedbrytning och förlust av metaboliterna, medan överfrysning leder till vävnadsfragmentering under kryosectioning. Frystiden bör alltid testas först enligt tidigare rapporterade studier, och studien av utvecklingsmushjärnan som presenteras i detta dokument ger referenspunkterna för gnagare hjärnvävnad. För det tredje kommer det att krävas lämplig praxis för att skära av biologiska vävnader och överföra deras sektioner till ITO-bilderna. Det är viktigt att notera att när du använder borsten för att plocka upp avsnittet från scenen bör borsten användas försiktigt. Låt borsten endast komma i kontakt med vävnadsdelens kanter för att minska risken för kontaminering och fragmentering av sektioner. Platta till avsnittet på bilden så mycket som möjligt, detta förhindrar curling av avsnittet under fingeruppvärmning. För det fjärde, när du monterar på ITO-bilden, se till att hela sektionen är väl ansluten till ITO-bilden eftersom olika delar av vävnaden kan kräva olika tid för fingeruppvärmning. Till exempel kräver hjärntumörvävnad längre uppvärmningstid än normal hjärnvävnad. En dålig montering kan leda till lossning och fragmentering av vävnaden under MALDI-MS skanning. Tänk på att fingeruppvärmningen kan möjliggöra enzymaction och metabolism som orsakar artefaktiska förändringar av metaboliter. För det femte spelar en fin och enhetlig nedfall av MALDI-matrisen en viktig roll för att uppnå korrekt rumslig information och stark MALDI-MS-signal. Det rekommenderas att testa matrisbesprutningen på en tom diabild och observera kristallmönstret under ett mikroskop för att verifiera korrekt täckning innan du fortsätter till beläggningen av ädelprovsrutschbana. Och slutligen, eftersom en enskild forskare utför vävnadsskörden och glidpreparatet i olika hastigheter, skulle det vara idealiskt att ha en person att hantera provberedningen för provet i samma kohort, för att minimera variationen.
I protokollet ovan anges standardförfaranden som kan anpassas efter behoven hos vissa experiment. Till exempel kan en kryosektionerande gel OCT, som normalt används vid kryosektionering av provet, användas ytterligare som ett monteringslim till vävnadschucken (som i studien som beskrivs ovan). Tidigare studier har visat att polymerkomponenten i OCT orsakar stark jonsuppression14. Inbäddning av provet kan dock vara oundvikligt i de fall där vävnaden är för bräcklig för att skäras utan ytterligare stöd från en polymergel. För att bekämpa signaldämpning i dessa fall kan vävnaderna behöva tvättas med seriell tvättning i 70% etanol och 95% etanol för att avlägsna återstående OCT för påvisande av proteiner eller lipider, medan tvättning inte rekommenderas för påvisande av små molekylära metaboliter9.
MALDI MSI har blivit allt mer relevant i både forskningslaboratoriet och klinisk praktik. Till exempel har MALDI MSI nyligen visat sig användbart i studier av proteomik för att karakterisera fenotypisk funktionell status hos en organism15, och för att fungera som ett medel för mikrobiell identifiering och diagnos av efterföljande sjukdom16. Medan MALDI MSI stöder ett brett spektrum av applikationer, finns det vissa begränsningar förknippade med att enbart förlita sig på denna teknik, särskilt när det gäller att skilja mellan liknande arter eller metaboliter och identifiering av specifika mål. En annan utmaning är kvantifieringen av metabolitkoncentrationen enligt MALDI MSI-signaler. Det antas ofta att jonöverskott i MALDI MSI-spektra och den rumsliga fördelningen (eller relativa överflöd) av motsvarande molekylära arter över dissekerade vävnader är väl korrelerade. Man bör dock alltid komma ihåg att förhållandet mellan jonintensitet och mängden motsvarande molekylära arter kompliceras av många faktorer, inklusive, men inte begränsat till, effekter av jonsuppression, förändringar i vävnadsstruktur och jonmolekylreaktioner17. Tekniker som använder interna standarder kan implementeras för absolut kvantifiering (μmol/g vävnad) i MALDI-MSI18. Dessa två utmaningar hanteras vanligtvis med det kombinerade arbetsflödet för MALDI MSI med flytande kromatografi tandem MS(LC-MS/MS) tekniker, varigenom mald-MS möjliggör kartläggning av den region av intresse, som senare utsätts för mikroextraktion och LC-MS/MS för att ge mer information för att identifiera metaboliten19.
MS-baserade avbildningsmetoder har utvecklats under de senaste åren som ett alternativ modalitet till tidigare tekniker för avbildning av små molekylmetaboliter. Med utvecklingen och den växande populariteten hos MALDI MSI förväntas MALDI-avbildning bli ett nytt standardverktyg för visualisering av små molekyler. Avbildning av lipid och endogena små molekyler (t.ex. signalsubstanser och metaboliter) i det biologiska sammanhanget, samt avbildning av xenobiotika för utveckling av nya farmaceutiska medel är av särskilt intresse. Dessa tre områden förväntas ha snabba framsteg med tillämpning av MALDI MSI inom en snar framtid20.
The authors have nothing to disclose.
Ye He och Rinat Abzalimov stöds av Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen och Kelly Veerasammy stöds av Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |