Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrophysiologischen In-vitro-Systems zur Untersuchung von Brustkrebs unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe mit Handelsmaterialien.
Abstract
Brustkrebs (BC) bleibt eine der häufigsten Todesursachen für Frauen. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien. Daher sind neue Modelle erforderlich, um unser Verständnis der Krankheit zu verbessern. Das NIH Microphysiological Systems (MPS) Programm wurde entwickelt, um die klinische Translation von Grundlagenforschungsentdeckungen und vielversprechenden neuen therapeutischen Strategien zu verbessern. Hier stellen wir eine Methode zur Erzeugung von MPS bei Brustkrebs (BC-MPS) vor. Dieses Modell adaptiert einen zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Fettgewebe (WAT), indem WAT zwischen fettbasierten Stammzellblättern (ASC) eingebettet wird. Zu den neuen Aspekten unseres BC-MPS gehören die Aussaat von BC-Zellen in nicht erkranktes menschliches Brustgewebe (HBT), das native extrazelluläre Matrix, reife Adipozyten, ansässige Fibroblasten und Immunzellen enthält; und Sandwiching der BC-HBT-Beimischung zwischen HBT-abgeleiteten ASC-Platten. Das resultierende BC-MPS ist in Kultur ex vivo für mindestens 14 Tage stabil. Dieses Modellsystem enthält mehrere Elemente der Mikroumgebung, die BC beeinflussen, einschließlich Adipozyten, Stromazellen, Immunzellen und der extrazellulären Matrix. So kann BC-MPS verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen BC und seiner Mikroumgebung zu untersuchen.
Wir demonstrieren die Vorteile unseres BC-MPS, indem wir zwei BC-Verhaltensweisen untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs beeinflussen: 1) BC-Motilität und 2) BC-HBT-metabolisches Crosstalk. Während die BC-Motilität bisher mit intravitalen Bildgebung nachgewiesen wurde, ermöglicht BC-MPS eine hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie über mehrere Tage. Während das metabolische Übersprechen zuvor mit BC-Zellen und murinen Präadipozyten demonstriert wurde, die in unreife Adipozyten differenziert wurden, ist unser BC-MPS-Modell das erste System, das dieses Crosstalk zwischen primären menschlichen Brustadipozyten und BC-Zellen in vitro demonstriert.
Introduction
Jedes Jahr sterben mehr als 40.000 US-Frauen an Brustkrebs (BC)1. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien2,3. Neue Modelle sind erforderlich, um die Medikamentenentwicklungspipeline und unser Verständnis von BC zu verbessern. Das NIH Microphysiological (MPS) Program berennt die Merkmale, die für bahnbrechende Modelle zur Verbesserung der Umsetzung von Grundlagenforschung in klinischen Erfolg erforderlich sind4. Dazu gehörten die Verwendung von primären menschlichen Zellen oder Geweben, die 4 Wochen lang in Kultur stabil sind, und die Einbeziehung der nativen Gewebearchitektur und der physiologischen Reaktion.
Aktuelle In-vitro-BC-Modelle, wie die zweidimensionale Kultur von BC-Zelllinien, die Membraneinfüge-Co-Kultur und dreidimensionale Sphäroide und Organoide, erfüllen die MPS-Kriterien des NIH nicht, da keines dieser Modelle die native Brustgewebearchitektur rekapituliert. Wenn extrazelluläre Matrix (ECM) zu diesen Systemen hinzugefügt wird, wird Brust-ECM nicht verwendet; Stattdessen werden Kollagengele und Basalmembranmatrizen verwendet.
Aktuelle In-vivo-Systeme, wie patientenabgeleitete Xenografts (PDX), erfüllen ebenfalls nicht die MPS-Kriterien des NIH, da sich das murine Brustgewebe stark von den menschlichen Brüsten unterscheidet. Darüber hinaus werden Interaktionen zwischen Immunsystem und BC zunehmend als Schlüssel zur Tumorentwicklung anerkannt, aber den immungeschwächten murinen Modellen, die zur Erzeugung von PDX-Tumoren verwendet werden, fehlen reife T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen. Während PDX es ermöglicht, primäre Brusttumoren zu erhalten und zu erweitern, werden die resultierenden PDX-Tumoren mit primären murinen Stromazellen und ECM5infiltriert.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir ein neuartiges, ex vivo, dreidimensionales menschliches Brust-MPS entwickelt, das die NIH-MPS-Kriterien erfüllt. Die Grundlage unseres Brust-MPS besteht darin, primäres menschliches Brustgewebe (HBT) zwischen zwei Blättern von fettabgeleiteten Stammzellen (ASCs) zu schalten, die ebenfalls aus HBT isoliert wurden (Abbildung 1). Kolben zum Übertragen der Zellplatten auf Sandwich der HBT können 3D-gedruckt oder aus einfachen Acrylkunststoffen hergestellt werden (Abbildung 1H, I). Diese Technik adaptiert unseren zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Adipozytengewebe6,7. Das Brust-MPS kann dann mit einem BC-Modell der Wahl gesät werden, das von Standard-BC-Zelllinien bis hin zu primären menschlichen Brusttumoren reicht. Hier zeigen wir, dass diese BC-MPS in Kultur über mehrere Wochen stabil sind (Abbildung 2); enthalten native Elemente von HBT wie Brustadipozyten, ECM, Endothel, Immunzellen (Abbildung 3); und rekapitulieren die physiologischen Wechselwirkungen zwischen BC und HBT wie metabolisches Übersprechen (Abbildung 4). Schließlich zeigen wir, dass BC-MPS die Untersuchung der Amöbenbewegung von BC-Zellen während hbT ermöglicht (Abbildung 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Neue Systeme zur Modellierung von menschlichem Brustkrebs sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu entwickeln. Die Entwicklung menschlicher mikrophysiologischer Systeme zur Modellierung von Krankheitseinstellungen, die native ECM- und Stromazellen umfassen, wird die Vorhersagekraft präklinischer Studien erhöhen. Das hier vorgestellte BC-MPS-Modell ist ein neu entwickeltes System, das die Einschränkungen früherer Modelle überwindet und die Auswertung von BC in seiner nativen HBT-Umgebung ermö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core sowie dem Tulane Histology Core für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant und der National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) unterstützt.
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
References
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