इंटरकनेक्टेड न्यूरॉन्स के माइक्रोन-स्केल संगठन के लिए चुंबकीय प्लेटफार्मों का निर्माण
Summary
यह काम न्यूरोनल संगठन के नियंत्रण के लिए स्थानीय चुंबकीय बलों की इंजीनियरिंग के लिए एक बॉटम-अप दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। चुंबकीय नैनोकणों (एमएएनपी) से भरी न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं को ऊपर चढ़ाया जाता है और लंबवत चुंबकीयकरण के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाले मंच द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा चुंबकीय लक्षण वर्णन, एमएनपी सेलुलर तेज, सेल व्यवहार्यता, और सांख्यिकीय विश्लेषण कर रहे हैं वर्णित हैं ।
Abstract
संगठित तंत्रिका नेटवर्क में न्यूरॉन्स को निर्देशित करने की क्षमता पुनर्योजी चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग, और जैव-इंटरफेसिंग के लिए बहुत निहितार्थ है। कई अध्ययनों का उद्देश्य रासायनिक और स्थलाकृतिक संकेतों का उपयोग करके न्यूरॉन्स को निर्देशित करना है। हालांकि, बड़े क्षेत्रों में एक माइक्रोन पैमाने पर संगठनात्मक नियंत्रण की रिपोर्ट दुर्लभ हैं । यहां, पूर्व निर्धारित स्थलों में न्यूरॉन्स रखने और सूक्ष्म पैटर्न वाले, चुंबकीय तत्वों के साथ एम्बेडेड चुंबकीय प्लेटफार्मों का उपयोग करके, माइक्रो-स्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ न्यूरोनल आउटग्रोथ का मार्गदर्शन करने के लिए एक प्रभावी विधि का वर्णन किया गया है। यह प्रदर्शित किया गया है कि चुंबकीय नैनोकणों (एमएएनपी) के साथ न्यूरॉन्स लोड िंग उन्हें संवेदनशील चुंबकीय इकाइयों में परिवर्तित करता है जो चुंबकीय ढाल से प्रभावित हो सकते हैं। इस दृष्टिकोण के बाद, एक अद्वितीय चुंबकीय मंच तैयार किया गया है जिस पर PC12 कोशिकाओं, एक आम न्यूरॉन की तरह मॉडल, चढ़ाया और सुपरप्रामैग्नेटिक नैनोकणों के साथ भरी हुई थी । चुंबकीय पैटर्न की ओर प्रभावी आकर्षण बल प्रदान करने के लिए स्थिर लंबवत चुंबकीकरण के साथ फेरोमैग्नेटिक (एफएम) मल्टीलेयर की पतली फिल्में जमा की गईं। चुंबकीय प्लेटफार्मों के ऊपर प्लेटेड और विभेदित इन एमएनपी-लोडेड PC12 कोशिकाओं को अधिमानतः चुंबकीय पैटर्न से जोड़ा गया था, और न्यूराइट आउटग्रोथ को पैटर्न आकार के साथ अच्छी तरह से गठबंधन किया गया था, उन्मुख नेटवर्क बनाते थे। चुंबकीय गुणों के मात्रात्मक लक्षण वर्णन विधियां, सेलुलर एमएनपी तेज, सेल व्यवहार्यता, और परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किए जाते हैं। यह दृष्टिकोण तंत्रिका नेटवर्क गठन के नियंत्रण को सक्षम बनाता है और चुंबकीय बलों के हेरफेर के माध्यम से न्यूरॉन-टू-इलेक्ट्रोड इंटरफेस में सुधार करता है, जो नेटवर्क के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है और उपन्यास चिकित्सीय बायोइंटरफेसिंग दिशाओं की पेशकश कर सकता है।
Introduction
न्यूरॉन्स के माइक्रोपैटर्निंग में ऊतक उत्थान 1 ,2, 3,4,5 और न्यूरो-इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के विकास की अपार संभावनाएं हैं6,7,8. हालांकि, उच्च स्थानिक संकल्प पर न्यूरॉन्स की माइक्रोन-स्केल्ड स्थिति, जैविक ऊतकों के रूप में, एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गई है। इस पैमाने पर पूर्वसाइन्ड संरचनाओं को बनाने के लिए स्थानीय रूप से सोमा मोटिविटी और एक्सोनल आउटग्रोथ को नियंत्रित करके तंत्रिका कोशिका प्रक्रियाओं के मार्गदर्शन की आवश्यकता होती है। पिछले अध्ययनों में न्यूरोनल विकास का मार्गदर्शन करने के लिए रासायनिक और भौतिक संकेतों9,10,11,12 के उपयोग का सुझाव दिया गया है। यहां, एक उपन्यास दृष्टिकोण चुंबकीय क्षेत्र ढाल13, 14, 15, 16, 17द्वारा सेल पोजिशनिंगकोनियंत्रितकरने पर केंद्रितहै,जो एमएनपी से भरी कोशिकाओं को चुंबकीय-संवेदनशील इकाइयों में बदल रहा है, जिसे दूर से हेरफेर किया जा सकता है।
कुंज एट अल. जो चुंबकीय चिप और एमएनपी-भरी हुई कोशिकाओं का उपयोग कर सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए आवश्यक बल की विशेषता है, ने साबित कर दिया कि जल्दी अक्षीय विस्तार कोशिकाओं के अंदर यांत्रिक तनाव से ट्रिगर किया जा सकता है18। Tay et al. ने पुष्टि की कि उन्नत चुंबकीय क्षेत्र ढाल के साथ माइक्रो-निर्मित सब्सट्रेट्स कैल्शियम इंडिकेटर रंगों19का उपयोग करके एमएनपी के साथ किए गए तंत्रिका सर्किट की वायरलेस उत्तेजना की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, Tseng एट अल कोशिकाओं के अंदर नैनोकणों को मिलाया, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय नैनोपार्टिकल-मध्यस्थता बलों ने सेलुलर तनाव20से संपर्क किया । इससे माइक्रोमैग्नेटिक सब्सट्रेट्स के परिभाषित पैटर्न का निर्माण हुआ जिसने यांत्रिक बलों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में मदद की। स्थानीयकृत नैनोपार्टिकल-मध्यस्थता बलों के अनुप्रयोग से उत्पन्न सेलुलर तनाव20कोशिकाओं के भीतर नैनोकणों को मिलाकर हासिल किया गया था । एक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (सीएमओएस) -माइक्रोफ्लुइडिक हाइब्रिड सिस्टम ली एट अल द्वारा विकसित किया गया था, जिसने चुंबकीय मोतियों के साथ टैग की गई व्यक्तिगत कोशिकाओं की गति को नियंत्रित करने के लिए सीएमओएस चिप में माइक्रो-इलेक्ट्रोमैग्नेट की एक सरणी एम्बेडेड की थी21।
एलन एट अल ने22कोशिकाओं का पता लगाने के लिए चुंबकीय “हॉट स्पॉट” के रूप में सूक्ष्म पैमाने, पूर्व-प्रोग्राम, चुंबकीय पैड का उपयोग किया। विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानों पर नैनोकणों को स्थानीयकृत करने के लिए सूक्ष्म पैटर्न वाले चुंबकीय सरणी का उपयोग करकेकोशिकाओंके भीतर विशिष्ट गतिविधि को भी उत्तेजित किया जा सकता है । सेलुलर एमएनपी तेज सफलतापूर्वक जोंक, चूहा, औरमाउस प्राथमिक न्यूरॉन्स24, 25,26में प्रदर्शित किया गया है । यहां, यह एक चूहा PC12 pheochromocytoma सेल लाइन है, जो पहले MNPs27के उच्च तेज दिखाने के लिए सूचित किया गया है पर प्रदर्शन किया गया है । हाल के वर्षों में, एमएनपी के विभिन्न चिकित्सा अनुप्रयोग ों मेंकैंसर उपचार28, 29, 30,31में दवा वितरण और थर्मोथेरेपी शामिल हैं। विशेष रूप से, अध्ययन एमएनपी और न्यूरॉन नेटवर्क 32 ,33,34,35के अनुप्रयोगसे निपटतेहैं . हालांकि, एक एकल सेल स्तर पर MNPs का उपयोग कर न्यूरॉन्स के चुंबकीय संगठन आगे की जांच के हकदार हैं ।
इस काम में, न्यूरोनल व्यवस्था को नियंत्रित करने के लिए पूर्वसाइन्ड प्लेटफार्मों के माध्यम से स्थानीय चुंबकीय बलों को इंजीनियर करने के लिए एक बॉटम-अप दृष्टिकोण वर्णित किया गया है। एफएम मल्टीलेयर्स के माइक्रोन-स्केल पैटर्न का निर्माण प्रस्तुत किया गया है। यह अद्वितीय, एफएम बहुस्तरीय संरचना स्थिर लंबवत चुंबकीयकरण बनाती है जिसके परिणामस्वरूप सभी चुंबकीय पैटर्न की ओर प्रभावी आकर्षण बल होते हैं। इनक्यूबेशन के माध्यम से, MNPs PC12 कोशिकाओं में लोड किया गया, उंहें चुंबकीय संवेदनशील इकाइयों में बदल रहा है । एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं, चुंबकीय प्लेटफार्मों के ऊपर चढ़ाया और विभेदित, अधिमानतः चुंबकीय पैटर्न से जुड़े थे, और न्यूराइट आउटग्रोथ पैटर्न आकार के साथ अच्छी तरह से गठबंधन किया गया था, उन्मुख नेटवर्क बनाने । एफएम मल्टीलेयर्स और एमएनपी के चुंबकीय गुणों की विशेषता के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है, और सेलुलर एमएनपी तेज और सेल व्यवहार्यता परख के लिए तकनीक भी प्रस्तुत की गई है। इसके अतिरिक्त, न्यूरोनल विकास और परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के रूपोमेट्रिक पैरामीटर विस्तृत हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिनिधि परिणाम माइक्रोन-स्केल पर न्यूरोनल नेटवर्क गठन को नियंत्रित करने और व्यवस्थित करने के लिए प्रस्तुत पद्धति की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करते हैं। एमएनपी-लोडेड PC12 कोशिकाएं व्यवहार्य रहीं और ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को इजराइल के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय और इजरायली साइंस फाउंडेशन (569/16) द्वारा समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
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