将DNA晕制备与荧光原位杂交相结合,可以对基因组与核骨架的相互作用进行高分辨率分析。附着的基因组导致位于残余提取的细胞核内的杂交荧光信号,而非附着的基因组位于残余细胞核周围的DNA晕中。
基因组与细胞核内的几个结构相关联,以调节其活性并将其锚定在特定位置。这些结构统称为核骨架,包括核薄片、核仁和核体。尽管存在许多荧光原位杂交(FISH)变体来研究基因组及其组织,但这些变体通常受到分辨率的限制,并且无法提供有关基因组与核结构关联的信息。DNA晕法使用高盐浓度和非离子去垢剂来产生DNA环,这些DNA环通过基因组内的附着区域保持锚定在细胞核内的结构上。在这里,可溶性核蛋白,如组蛋白、脂质和与核基质不紧密结合的DNA,被提取出来。这导致在残余细胞核周围形成一个未连接的DNA晕,该残余细胞核本身含有与内部核结构和抗提取蛋白密切相关的DNA。这些延伸的DNA链可以提高分辨率,并促进物理映射。与FISH结合使用,该方法具有研究基因组与基因组锚定的所有结构的相互作用的额外优势。这种被称为HALO-FISH的技术用途广泛,DNA晕可以与核酸探针偶联,以揭示基因位点,整个染色体,α卫星,端粒甚至RNA。该技术提供了对正常细胞和疾病进展(如癌症)中核组织和功能的洞察。
“核矩阵”最早由别列兹尼和科菲在1974年描述1.在对大鼠肝核进行高盐摩尔萃取和核酸酶处理后,他们鉴定出蛋白质结构框架。DNA晕程序随后从该方法改编而来,涉及去除可溶性蛋白质,以便仅保留核基质(NM)和NM相关蛋白质和染色体。DNA附着区位于DNA环的底部,称为基质附着区(MAR)或支架附着区(SAR),它们分别耐高盐浓度和离子洗涤剂锂-3,5-二碘水杨酸酯(LIS)的提取。在DNA晕中,与MAR / SAR相关的DNA结合在残余细胞核内,而DNA环从这些位点延伸并形成DNA晕。我们现在知道,基因组通过薄片相关结构域(LAD)锚定到核层,通过核仁相关区(NAD),并可能通过其他核结构(如特定核体)锚定。
DNA晕环法可用于DNA,基因和染色体区域的物理定位,因为扩展的DNA和染色质提供了更高的分辨率,因为染色质被剥离了组蛋白并且DNA被拉伸2,3,4,5,6。但是,在此应用中使用DNA晕时存在一些限制。例如,探针可能无法接近与DNA晕的残余核紧密相关的DNA,从而将其排除在分析和物理映射之外6。其他技术,如fiber-FISH2,4,5,7和分子梳理8也支持物理映射,并具有相对快速和易于执行的优点。两者都优先用于DNA晕上的基因DNA图谱。这些方法通过使用溶剂或盐从细胞核中提取染色质纤维,然而,分子梳理往往具有更好的重现性8,9。
越来越多的证据表明,核骨架在支持关键核过程方面发挥作用,例如DNA的附着位点,染色质重塑,DNA转录,DNA修复和DNA复制11,12。因此,开发了DNA晕技术来研究这些细胞活动期间核骨架和基因组之间的相互作用,并已在研究中常规使用和报道。该技术还被用于研究基因组和核骨架与疾病进展相关的相互作用,并鉴定出与恶性肿瘤相关的核结构变化11。
DNA晕技术也被用于研究发育和分化过程中基因组和核骨架之间的关系12。许多研究使用了DNA晕轮技术的变体,称为被子植物13 或SpermHalo-FISH,如果与FISH14结合。精子染色质与称为鱼精蛋白的蛋白质紧密结合,该技术的开发是为了改善对精子DNA的访问。被子植物已被用于研究精子DNA的完整性并确定是否存在DNA损伤。DNA损伤较少的精子与较大的DNA晕环大小相关,而片段化和受损DNA水平增加的精子要么有小的光晕,要么根本没有。因此,被子植物可用作胚胎质量和IVF13成功怀孕的潜在预后标志物。这个例子强调了这种技术的潜在临床应用。在我们的工作中,我们使用HALO-FISH来评估基因组行为的变化以及特定药物治疗对过早衰老疾病哈钦森 – 吉尔福德早衰综合症(HGPS)的影响15。
总之,这些以及其他研究突出了DNA晕技术可用于研究和该技术的实用性的过程/应用的广度。
在分析核骨架和基因组之间的相互作用时,DNA晕法是一种极好的选择方法,但是,也必须遵守一些关键步骤。最重要的参数之一是细胞接种密度的优化。如果细胞过度汇合,那么DNA晕将与邻近细胞重叠,从而无法进行分析。CSK和提取缓冲液在使用当天必须始终保持新鲜,在制备过程结束时将精胺、亚精胺和洋地黄皂苷添加到提取缓冲液中,以保持其生物活性。如果进行Halo-FISH,则使用DNA晕的正确变性温度以使探针或油漆随后杂交非常重要。
电子显微镜已被用于可视化核基质,并鉴定丝状结构20。然而,电子显微镜检查是有限的,因为基质与染色质的关联不容易推断出来。事实上,与电子显微镜相比,DNA Halo方法更通用,因为可以检查特定的基因,染色体和细胞状态。此外,正在研究核基质蛋白的蛋白质组学分析21,22。这种方法适用于比较核基质成分,特别是在比较患病细胞时,但是,它不提供标准DNA晕轮技术突出显示的空间分布和附着。
DNA晕测定确实有局限性。首先,由于基质被提取,这只能在固定细胞上进行,因此无法进行实时成像。尽管DNA Halo方法相对快速且易于执行,但当将细胞培养,探针生成,Halo-FISH和分析全部考虑在内时,整个过程可能会非常耗时。
使用超分辨率显微镜捕获DNA晕和卤素鱼的图像将大大提高DNA特异性探针和抗体的分辨率。此外,由于荧光染料可以更容易地进行光谱分离,因此可以在单个实验中使用多个DNA探针,从而提供更多信息。分子生物学技术的改进,如染色体构象捕获(3C)已被用于确定基因位点的相互作用并分析细胞中染色质的空间组织。DNA晕测定和3C可以组合使用,称为M3C23,再次证明了DNA晕技术的适应性。
这里提供的原始数据是为了证明基因组行为询问的可能性以及如何呈现这些数据。有了这些数据,我们已经证明,使用(1)染色体绘画探针可以确定基因组附着的显着差异,在这项研究中,揭示了18号染色体是所分析染色体中附着最少的染色体(图3);(2)两个基因位点与(图4)(3)端粒之间有显着差异的基因位点,与增殖和衰老细胞相比,端粒在静止细胞中的附着力较低(图5)。我们能够通过增殖标记Ki67抗原的存在来区分增殖和非增殖细胞,Ki67抗原是一种不溶性蛋白质,因此保留在残留的细胞核中,或者使用核苷酸的掺入来突出显示在特定时间段内通过S期的细胞(图2)。这项技术还使我们能够分析在其核骨头(即椎板病细胞)中受到损害的细胞中的基因组行为,在这里和Bikkul等人,2018年,我们发现与对照细胞相比,基因组可以不那么紧密地附着,并且在使用特定药物治疗时可以恢复,这些药物可以改善经典HGPS细胞中层粘连蛋白A突变的作用15.然而,我们在这里显示了非典型HGPS AGO8466细胞的新数据,缺乏层粘连蛋白A突变,但含有不寻常形式的LINC复合蛋白SUN119,染色体13 的附着力较低(图6)。
HALO-FISH 是一种独特的方法,它能够研究与核骨架的基因组相互作用,结合间接免疫荧光来解析未从提取过程中去除的蛋白质。已经证明,核骨架在各种疾病中被修饰,例如某些癌症类型19和某些核骨架相关蛋白作为诊断生物标志物的重要性24,25。因此,该技术在检查细胞骨架对疾病15,24,25,27中染色质组织/组织失理的影响方面具有重要作用,并且不仅限于人类细胞,使用来自其他动物的染色体绘画探针,可以采用相同的DNA-halo协议28。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Michael Bittner教授对染色体手臂绘画探针的善意礼物。LG得到了欧盟资助的EURO-Laminopathies项目和布鲁内尔早衰研究基金的支持。
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |