Genom att kombinera DNA-halopreparat med fluorescens in situ-hybridisering möjliggörs högupplöst analys av genomiska interaktioner med nukleoskelettet. Bifogat genom leder till hybridiserade fluorescerande signaler belägna inom de kvarvarande extraherade kärnorna, medan icke-bundet genom ligger i DNA-halo som omger restkärnorna.
Genomet är associerat med flera strukturer inuti cellkärnor för att reglera dess aktivitet och förankra den på specifika platser. Dessa strukturer är kollektivt kända som nukleoskelettet och inkluderar kärnlamina, nukleolerna och kärnkropparna. Även om många varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) finns för att studera genomet och dess organisation, är dessa ofta begränsade av upplösning och ger otillräcklig information om genomets samband med kärnstrukturer. DNA-halometoden använder höga saltkoncentrationer och nonjoniska tvättmedel för att generera DNA-slingor som förblir förankrade i strukturer inom kärnor genom bindningsregioner i genomet. Här extraheras lösliga kärnproteiner, såsom histoner, lipider och DNA som inte är tätt bundna till kärnmatrisen. Detta leder till bildandet av en halo av obundet DNA som omger en kvarvarande kärna som i sig innehåller DNA nära associerat med inre kärnstrukturer och extraktionsresistenta proteiner. Dessa utökade DNA-strängar möjliggör ökad upplösning och kan underlätta fysisk kartläggning. I kombination med FISH har denna metod den extra fördelen att den studerar genomiska interaktioner med alla de strukturer som genomet är förankrat i. Denna teknik, som kallas halo-fisk, är mycket mångsidig varigenom DNA-halos kan kopplas med nukleinsyrasonder för att avslöja genlokus, hela kromosomer, alfasatellit, telomerer och till och med RNA. Denna teknik ger en inblick i kärnans organisation och funktion i normala celler och i sjukdomsprogression som med cancer.
“Kärnmatrisen” beskrevs först av Berezney och Coffey 19741. Efter att ha utfört extraktioner med höga saltmolariteter och nukleasbehandling på råttleverkärnor identifierade de en proteinhaltig strukturell ram. DNA-haloproceduren anpassades därefter från denna metod och innebär avlägsnande av lösliga proteiner så att endast kärnmatrisen (NM) och NM-associerade proteiner och kromosomer kvarstår. DNA-fästregioner är belägna vid basen av DNA-slingor och kallas matrisfästa regioner (MAR) eller ställningsfästregioner (SAR), som är resistenta mot extraktion med höga saltkoncentrationer respektive jontvättmedel litium-3,5-dijodsalicylat (LIS). I DNA-halos är DNA associerat med MAR / SAR bundet inom restkärnan medan DNA-slingorna sträcker sig bort från dessa platser och bildar DNA-halo. Vi vet nu att genomet är förankrat via lamina associerade domäner (LAD) till nukleära lamina och genom nukleolära associerade regioner (NADs) och eventuellt genom andra kärnstrukturer såsom specifika kärnkroppar.
DNA-halometoden kan användas för fysisk kartläggning av DNA, gener och kromosomala regioner eftersom det utökade DNA och kromatin ger en större upplösning eftersom kromatinet avlägsnas från histoner och DNA sträcks ut 2,3,4,5,6. Det finns dock vissa begränsningar när du använder DNA-halor för denna applikation. Till exempel kan DNA som är tätt associerat med kvarvarande kärnor i DNA-halos vara otillgängligt för sonder, vilket utesluter det från analys och fysisk kartläggning6. Andra tekniker som fiber-FISH 2,4,5,7 och molekylär kamning 8 möjliggör också fysisk kartläggning och har fördelen att vara relativt snabb och enkel att utföra. Båda används företrädesvis för DNA-kartläggning av gener över DNA-halos. Dessa metoder extraherar kromatinfibrer via användning av lösningsmedel eller saltextraktioner från kärnan, men molekylär kamning tenderar att ha bättre reproducerbarhet 8,9.
Det finns ett ökande bevis för att nukleoskelettet har en roll i att stödja viktiga kärnprocesser, såsom fästplatser för DNA, kromatinremodellering, DNA-transkription, DNA-reparation och DNA-replikation11,12. Som sådan utvecklades DNA-halotekniken för att undersöka interaktionerna mellan nukleoskelettet och genomet under dessa cellulära aktiviteter och har rutinmässigt använts och rapporterats i forskning. Denna teknik har också använts för att undersöka interaktioner mellan genomet och nukleoskelettet i relation till sjukdomsprogression med malignitetsrelaterade förändringar i kärnstruktur som identifierats11.
DNA-halotekniken har också använts för att undersöka förhållandet mellan genomet och nukleoskelettet under utveckling och differentiering12. Ett antal studier har använt en variant av DNA-halotekniken som kallas halosperm13 eller SpermHalo-FISH om den kombineras med FISH14. Spermatozoakromatin är tätt bundet till proteiner som kallas protaminer och denna teknik utvecklades för att förbättra tillgången till spermiernas DNA. Halosperm har använts för att undersöka integriteten hos spermatozoa DNA och avgöra om DNA-skador är närvarande. Spermatozoa med mindre DNA-skador korrelerar med en större DNA-halostorlek, medan spermatozoer med ökade nivåer av fragmenterat och skadat DNA hade antingen små halor eller ingen alls. Således kan halosperm användas som en potentiell prognostisk markör för embryokvalitet och framgångsrik graviditet med IVF13. Detta exempel betonar de potentiella kliniska tillämpningarna av denna teknik. I vårt arbete har vi använt HALO-FISH för att bedöma förändringar i genombeteende och effekten av specifika läkemedelsbehandlingar vid sjukdomen för tidigt åldrande Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Tillsammans belyser dessa, och andra studier, bredden av processer/tillämpningar som DNA-halotekniken kan användas för att studera och användbarheten av tekniken.
DNA-halometoden är en utmärkt metod att välja när man analyserar interaktioner mellan nukleoskelettet och genomet, men det finns några kritiska steg som också måste följas. En av de viktigaste parametrarna är optimeringen av cellsådddensiteten. Om celler blir översammanflytande, kommer DNA-halorna att överlappa med angränsande celler vilket gör det omöjligt att utföra analysen. CSK- och extraktionsbuffertarna måste alltid göras färska på användningsdagen och spermin, spermidin och digitonin tillsätts extraktionsbufferten i slutet av beredningsprocessen för att bibehålla sin biologiska aktivitet. Om du utför Halo-FISH är det extremt viktigt att använda rätt denatureringstemperatur för DNA-halorna för att sonden eller färgen därefter ska kunna hybridiseras.
Elektronmikroskopi har använts för att visualisera kärnmatrisen, med filamentösa strukturer som identifieras20. Elektronmikroskopi är emellertid begränsad eftersom matrisföreningar med kromatin inte lätt kan härledas. Faktum är att DNA Halo-metoden är mer mångsidig jämfört med elektronmikroskopi eftersom specifika gener, kromosomer och celltillstånd alla kan undersökas. Vidare studeras proteomisk analys av kärnmatrisproteiner21,22. Denna metod är bra för att jämföra kärnmatriskomponenter, särskilt när man jämför sjuka celler, men den ger inte den rumsliga fördelningen och bilagorna som markeras av standard DNA Halo-tekniken.
DNA Halo-analyser har begränsningar. För det första, eftersom matrisen extraheras, kan detta endast utföras på fasta celler så levande avbildning är inte möjlig. Även om DNA Halo-metoden är relativt snabb och enkel att utföra, kan den övergripande processen vara tidskrävande när cellodling, sondgenerering, Halo-FISH och analys beaktas.
Bildtagning av DNA-halos och halo-fish med hjälp av superupplösningsmikroskopi skulle avsevärt förbättra upplösningen av DNA-specifika sonder och antikroppar. Dessutom, eftersom fluorokromer lättare kan lösas spektralt, kan det vara möjligt att använda ett antal DNA-sonder i ett enda experiment, vilket ger ännu mer information. Förbättringar i molekylärbiologiska tekniker såsom kromosomkonformationsfångst (3C) har använts för att bestämma interaktioner mellan genlokus och analysera den rumsliga organisationen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser och 3C kan kombineras, en term som kallas M3C23, vilket återigen visar anpassningsförmågan hos DNA Halo-tekniken.
De ursprungliga data som presenteras här är att visa möjligheterna för genombeteendeförhör och hur man presenterar dessa data. Med dessa data har vi visat att det är möjligt att bestämma signifikanta skillnader i genombindning med hjälp av (1) kromosommålningssonder, i denna studie avslöjar kromosom 18 att vara den minst fästa kromosomen av de analyserade (Figur 3); (2) Genlokus med signifikanta skillnader mellan två genlokus och (figur 4) (3) Telomerer, som är mindre starkt bundna i vilande celler jämfört med prolifererande och senescenta celler (figur 5). Vi kan skilja mellan prolifererande och icke-prolifererande celler via närvaron av proliferationsmarkören Ki67-antigen, vilket är ett olösligt protein, så förblir med restkärnorna eller använder införlivandet av nukleotider för att markera celler som har gått igenom S-fas inom en viss tidsperiod (Figur 2). Denna teknik har också gjort det möjligt för oss att analysera genombeteende i celler som är komprometterade i sina nukleoskelett, dvs laminopaticeller, och här och i Bikkul et al., 2018, avslöjar vi att genomet kan vara mindre tätt fäst jämfört med kontrollceller och kan återställas vid behandling med specifika läkemedel som förbättrar effekten av lamin A-mutationen i klassiska HGPS-celler15. Vi visar dock nya data här för de atypiska HGPS AGO8466-cellerna, som saknar en lamin A-mutation men innehåller en ovanlig form av LINC-komplexproteinet SUN119 som kromosom 13 är mindre tätt fäst i (figur 6).
HALO-FISH är en unik metod som möjliggör studier av genomiska interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekt immunofluorescens för att lösa proteiner som inte avlägsnats från extraktionsproceduren. Det har visats att nukleoskelettet är modifierat vid olika sjukdomar såsom vissa cancertyper19 och betydelsen av vissa nukleoskelettassocierade proteiner som diagnostiska biomarkörer24,25. Således har denna teknik en viktig roll för att undersöka effekten av nukleoskelettet på kromatinorganisation / disorganisation vid sjukdom 15,24,25,27 och är inte begränsad till mänskliga celler, med kromosomala målningssonder från andra djur kan samma DNA-haloprotokoll användas 28.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka professor Michael Bittner för den vänliga gåvan av kromosomarmmålningssonder. LG stöddes av det EU-finansierade projektet EURO-Laminopathies och Brunel Progeria Research Fund.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |