Kemisk konjugation av en renad DEC-205-riktad antikropp med fulllängdsprotein för inriktning på mus dendritiska celler in vitro och in vivo
Summary
Vi beskriver ett protokoll för kemisk konjugation av modellen antigen ovalbumin till en endocytosis receptor-specifika antikropp för in vivo dendritic cell inriktning. Protokollet omfattar rening av antikroppen, kemisk konjugation av antigenet samt rening av konjugat och verifiering av effektiv konjugation.
Abstract
Riktad antigen leverans till kors-presentera dendritiska celler (DC) in vivo inducerar effektivt T effector cell svar och visar ett värdefullt tillvägagångssätt i vaccin design. Antigen levereras till DC via antikroppar som är specifika för endocytosreceptorer som DEC-205 som inducerar upptag, bearbetning och MHC klass I- och II-presentation.
Effektiv och tillförlitlig konjugation av önskat antigen till en lämplig antikropp är ett kritiskt steg i DC-inriktning och beror bland annat på antigenets format. Kemisk konjugation av protein i full längd till renade antikroppar är en möjlig strategi. Tidigare har vi framgångsrikt etablerat korslänkning av modellen antigen ovalbumin (OVA) och en DEC-205-specifik IgG2a antikropp (αDEC-205) för in vivo DC inriktning studier på möss. Det första steget i protokollet är rening av antikroppen från supernatanten av NLDC (icke-lymfoida dendritiska celler)-145 hybridom genom affinitetskromatografi. Den renade antikroppen aktiveras för kemisk konjugation av sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidometyl] cyklohexan-1-karboxoxylat) samtidigt som sulfhydrylgrupperna i OVA-proteinet exponeras genom inkubation med TCEP-HCl (tris (2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Överskott av TCEP-HCl och sulfo-SMCC avlägsnas och antigenet blandas med den aktiverade antikroppen för koppling över natten. Den resulterande konjugatet αDEC-205/OVA är koncentrerad och befriad från obundet OVA. Framgångsrik konjugation av OVA till αDEC-205 verifieras av western blot analys och enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).
Vi har framgångsrikt använt kemiskt tvärbundna αDEC-205/OVA för att inducera cytotoxiska T-cellssvar i levern och för att jämföra olika adjuvanser för deras potential att inducera humoral och cellulär immunitet efter in vivo-inriktning på DEC-205+ DC. Utöver detta erbjuder sådana kemiskt kopplade antikropps-/antigenkonjugater värdefulla verktyg för effektiv induktion av vaccinsvar på tumörantigener och har visat sig vara överlägsna klassiska immuniseringsmetoder när det gäller förebyggande och behandling av olika typer av tumörer.
Introduction
Dendritiska celler (DC) är centrala aktörer i immunsystemet. De är en mångsidig grupp celler specialiserade på antigenpresentation och deras huvudsakliga funktion är att överbrygga medfödd och adaptiv immunitet1,2. Viktigt är att DC inte bara spelar en viktig roll i effektiva och specifika patogenstyrda svar utan också är involverade i många aspekter av antitumörimmunitet1,3.
På grund av deras exklusiva roll i värdimmunitet kom DC i fokus som målceller för vaccination4. Ett tillvägagångssätt är att rikta antigener till DC in vivo för att inducera antigenspecifika immunsvar och under de senaste åren har ett stort antal studier ägnats åt att definiera lämpliga receptorer och inriktningsstrategier1,4. Ett exempel är C-typ lektinreceptorn DEC-205, som kan riktas mot DEC-205-specifika antikroppar för att inducera endocytos. Viktigt är att DEC-205-inriktning i kombination med lämpliga adjuvanser har visat sig effektivt inducera långlivade och skyddande CD4+ och CD8+ T-celler, liksom antikroppssvar, även mot tumörantigener3,5,6,7,8,9.
Det finns ett antal studier som visar att konjugerade antigener riktade till DC är överlägsna fria icke-konjugerade antigen3,5,10,11,12. Detta gör konjugationen av antigenet till respektive DC-inriktning moiety ett centralt steg i DC-inriktningsmetoder. När det gäller dc-inriktning via antikroppar eller antikroppsfragment kan antigener vara antingen kemiskt eller genetiskt kopplade och endera strategin ger sina egna (dis)fördelar1. Å ena sidan finns det i genetiskt konstruerade antikropps-antigenkonstruktioner en kontroll över antigendosen samt den plats som ger överlägsen jämförbarhet mellan del1. Samtidigt behöver dock kemisk konjugation mindre förberedelse och ger större flexibilitet, särskilt när man försöker testa och jämföra olika antigener och/eller vaccinationsstrategier i experimentella och prekliniska modeller.
Här presenterar vi ett protokoll för effektiv och tillförlitlig kemisk konjugation av ovalbumin (OVA) som modellproteinantigen till en DEC-205-specifik IgG2a-antikropp (αDEC-205) lämplig för in vivo DC-inriktning hos möss. Först renas αDEC-205 från NLDC-145 hybridomceller13. För kemisk konjugation används heterobifunctional tvärlänk sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), som innehåller NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- och maleimidegrupper, vilket möjliggör kovalent konjugation av amine- och sulfhydrylinnehållande molekyler. Specifikt reagerar de primära aminer av antikroppen initialt med sulfo-SMCC och den resulterande maleimidaktiverade αDEC-205 reagerar sedan med det sulfhydrylinnehållande OVA-proteinet reducerat genom TCEP-HCl (Tris(2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Slutprodukten är kemiskt konjugerad αDEC-205/OVA(figur 1). Utöver kemisk konjugation i sig beskriver vårt protokoll avlägsnande av överskott av OVA från konjugat samt verifiering av framgångsrik konjugation genom western blot analys och en specifik enzym-linked immunosorbent analys. Vi har framgångsrikt använt detta tillvägagångssätt tidigare för att kemiskt konjugera OVA och andra proteiner eller immunogenic peptider till αDEC-205. Vi visar effektiv bindning till CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion av cellulär och humoral immunitet in vivo.
Visst finns det nackdelar med denna metod som i parti-till-parti jämförbarhet och i den exakta doseringen av antigenet inom den slutliga konjugaten. Icke desto mindre ger kemisk konjugation experimentell flexibilitet i valet av antikropp och proteinantigen jämfört med genetiskt konstruerade konstruktioner. Därför anser vi att detta tillvägagångssätt är särskilt värdefullt vid utvärdering av olika antigener för deras effektivitet i DC-inriktning i prekliniska musmodeller, viktigt även i samband med specifika antitumör immunsvar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemisk konjugation av en endocytosreceptorspecifik antikropp och ett proteinantigen ger ett effektivt och, viktigast av allt, också flexibelt tillvägagångssätt för in vivo DC-inriktning i prekliniska musmodeller. Med vårt protokoll tillhandahåller vi ett effektivt tillvägagångssätt för framgångsrik konjugation av modellantigenet OVA till en DEC-205-specifik IgG-antikropp.
I vårt protokoll renas αDEC-205 från en hybridomcelllinje och tidigare har vi renat antikroppen med…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar S. Prettin för expertteknisk hjälp. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) som tillhandahölls som en del av Helmholtz Alliance ”Immunotherapy of Cancers’ (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
