Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu
Summary
Model antijen ovalbumin’in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.
Abstract
Çapraz sunum dendritik hücrelere (DC) hedeflenen antijen in vivo, T efektör hücre yanıtlarını verimli bir şekilde indükler ve aşı tasarımında değerli bir yaklaşım sergiler. Antijen, DEC-205 gibi endositoz reseptörlerine özgü antikorlar aracılığıyla DC’ye teslim edilir ve bu da alımı, işlenmesini ve MHC sınıfı I ve II sunumlarını teşvik eder.
İstenilen antijenin uygun bir antikora verimli ve güvenilir bir şekilde konjugasyonu DC hedeflemesinde kritik bir adımdır ve diğer faktörlerin yanı sıra antijenin formatına bağlıdır. Tam boy proteinin saflaştırılmış antikorlara kimyasal konjugasyonu olası bir stratejidir. Geçmişte, farelerde in vivo DC hedefleme çalışmaları için antijen ovalbumin (OVA) ve DEC-205’e özgü IgG2a antikorunun (αDEC-205) çapraz bağlamasını başarıyla kurduk. Protokolün ilk adımı, antikorun NLDC (lenfoid olmayan dendritik hücreler)-145 hibridomanın afinite kromatografisi ile üstnatantından arındırılmasıdır. Saflaştırılmış antikor, sülfo-SMCC (sülfoksinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksila) tarafından kimyasal konjugasyon için aktive edilir.te) aynı zamanda OVA proteininin sülfhidrit grupları TCEP-HCl (tris (tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür ile inkübasyon yoluyla maruz kalır. Aşırı TCEP-HCl ve sülfo-SMCC çıkarılır ve antijen gece kaplin için aktif antikor ile karıştırılır. Elde edilen αDEC-205/OVA konjuge konsantre edilir ve ilişkisiz OVA’dan kurtulur. OVA’nın αDEC-205’e başarılı bir şekilde konjugasyonu batı blot analizi ve enzime bağlı immünosorbent tahlil (ELISA) ile doğrulanır.
Karaciğerde sitotoksik T hücre yanıtlarını teşvik etmek ve DEC-205+ DC’nin in vivo hedeflemesini takiben humoral ve hücresel bağışıklığı teşvik etme potansiyelleri için farklı yardımcıları karşılaştırmak için kimyasal olarak çapraz bağlı αDEC-205/OVA’yı başarıyla kullandık. Bunun ötesinde, bu tür kimyasal olarak birleştirilmiş antikor/ antijen konjugeleri, tümör antijenlerine aşı yanıtlarının verimli bir şekilde indüksiyonu için değerli araçlar sunar ve çeşitli tümör türlerinin önlenmesi ve tedavisi ile ilgili klasik bağışıklama yaklaşımlarından daha üstün olduğu kanıtlanmıştır.
Introduction
Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin merkezi oyuncularıdır. Antijen sunumu konusunda uzmanlaşmış çeşitli bir hücre grubudur ve başlıca işlevleri doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık arasında köprü yapmaktır1,2. Daha da önemlisi, DC sadece verimli ve spesifik patojene yönelik yanıtlarda önemli bir rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda antitümör bağışıklığının birçok yönüne de katılır1,3.
Konak bağışıklığındaki özel rolleri nedeniyle, DC aşılama için hedef hücreler olarak odak noktasına geldi4. Bir yaklaşım, antijene özgü immün yanıtları teşvik etmek için antijenleri DC in vivo’ya hedeflemektir ve son yıllarda, çok sayıda çalışma uygun reseptörleri tanımlamaya ve stratejileri hedeflemeye adanmıştır1,4. Örneklerden biri, endositoz indükleyen DEC-205 spesifik antikorlar tarafından hedeflenebilen C tipi lektin reseptörü DEC-205’tir. Daha da önemlisi, UYGUN adjuvanlarla kombinasyondaki DEC-205 hedeflemesinin, tümör antijenleri 3 ,5,6,7, 8, 9’akarşı antikor yanıtlarının yanı sıra uzun ömürlü ve koruyucu CD4 + veCD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde teşvik ettiği gösterilmiştir.
DC’ye yönelik konjuge antijenlerin serbest konjuge edilmemiş antijen 3 ,5,10,11,12’denüstün olduğunu gösteren bir dizi çalışma vardır. Bu, antijenin ilgili DC hedefleme moiety’ye konjugasyonunu DC hedefleme yaklaşımlarında merkezi bir adım haline getirir. Antikorlar veya antikor parçaları aracılığıyla DC hedeflemesi durumunda, antijenler kimyasal veya genetik olarak bağlanabilir ve strateji kendi (dis) avantajlarını sağlar1. Bir yandan, genetik olarak tasarlanmış antikor-antijen yapılarında, antijen dozu üzerinde bir kontrol ve lotlar arasında üstün karşılaştırılma sağlayan konumvardır 1. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon daha az hazırlık gerekir ve özellikle deneysel ve klinik öncesi modellerde farklı antijenleri ve / veya aşılama stratejilerini test etmeye ve karşılaştırmaya çalışırken daha fazla esneklik sağlar.
Burada, ovalbumin (OVA) model protein antijeni olarak, farelerde in vivo DC hedeflemeye uygun bir DEC-205 spesifik IgG2a antikoru (αDEC-205) için verimli ve güvenilir kimyasal konjugasyon için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, αDEC-205 NLDC-145 hibridoma hücrelerinden arındırılır13. Kimyasal konjugasyon için, NHS (N-hydroxysuccinimide) ester ve maleimid gruplarını içeren heterobifunctional crosslinker sülfosinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksane-1-karboksilat (sulfo-SMCC), amin ve sülfhidrit içeren moleküllerin kovalansiyel konjugasyonuna izin veren kullanılır. Spesifik olarak, antikorun birincil aminleri başlangıçta sülfo-SMCC ile reaksiyona girer ve ortaya çıkan maleimid-aktive αDEC-205 daha sonra TCEP-HCl (Tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür yoluyla azaltılmış sülfhidrit içeren OVA proteini ile reaksiyona girer. Nihai ürün kimyasal olarak konjuge αDEC-205/OVA(Şekil 1). Kimyasal konjugasyonun kendisinin ötesinde, protokolümüz fazla OVA’nın konjugeden çıkarılmasını ve batı blot analizi ve belirli bir enzime bağlı immünorbent test yoluyla başarılı konjugasyonun doğrulanmasını açıklar. Ova ve diğer proteinleri veya immünojenik peptitleri αDEC-205’e kimyasal olarak konjuge etmek için bu yaklaşımı geçmişte başarıyla çalıştırdık. CD11c+ hücreler in vitro’ya verimli bağlamanın yanı sıra hücresel ve humoral bağışıklığın verimli indüksiyonunu vivo.
Elbette, bu yöntemin dezavantajları vardır, örneğin çok-çok karşılaştırılma ve antijenin son konjuge içinde tam olarak yapılması gibi. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon, genetik olarak tasarlanmış yapılara kıyasla antikor ve protein antijen seçiminde deneysel esneklik sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın özellikle klinik öncesi fare modellerinde DC hedeflemesinde verimliliği için farklı antijenlerin değerlendirilmesinde, özellikle de spesifik antitümör immün yanıtlar bağlamında değerli olduğuna inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endositoz reseptörüne özgü antikor ve protein antijeninin kimyasal konjugasyonu, klinik öncesi fare modellerinde in vivo DC hedeflemesi için verimli ve daha da önemlisi esnek bir yaklaşım sağlar. Protokolümüzle, model antijen OVA’nın DEC-205’e özgü bir IgG antikoru için başarılı bir şekilde konjugasyonu için verimli bir yaklaşım sağlıyoruz.
Protokolümüze göre, αDEC-205 bir hibridoma hücre hattından arındırıldır ve geçmişte, tanımlandığı gibi G …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar uzman teknik yardımı için S. Prettin’e teşekkür eder. Bu çalışma Helmholtz Alman Araştırma Merkezleri Birliği’nin (HGF) Helmholtz İttifakı ”Kanserlerin İmmünoterapisi’ (HCC_WP2b) kapsamında sağlanan bir hibe ile desteklendi.
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
