Nettoyage des tissus à base de CLARTÉ raffiné pour l’organisation tridimensionnelle des fibroblastes dans les cœurs de souris sains et blessés
Summary
Une méthode raffinée de dégagement de tissu a été développée et appliquée au coeur adulte de souris. Cette méthode a été conçue pour effacer le tissu cardiaque dense et autofluorescent, tout en maintenant la fluorescence étiquetée de fibroblaste attribuée à une stratégie génétique de rapporteur.
Abstract
La maladie cardio-vasculaire est la cause la plus répandue de mortalité dans le monde entier et est souvent marquée par la fibrose cardiaque accrue qui peut mener à la rigidité ventriculaire accrue avec la fonction cardiaque changée. Cette augmentation de la fibrose ventriculaire cardiaque est due à l’activation des fibroblastes résidents, bien que la façon dont ces cellules fonctionnent dans le cœur à 3 dimensions (3D), à la ligne de base ou après l’activation, ne soit pas bien comprise. Pour examiner comment les fibroblastes contribuent aux maladies cardiaques et leur dynamique dans le cœur 3D, une méthode raffinée de nettoyage et d’imagerie des tissus basée sur CLARITY a été développée qui montre des fibroblastes cardiaques marqués par fluorescence dans tout le cœur de la souris. Les fibroblastes résidents des tissus ont été génétiquement marqués à l’aide de souris rapporteurs florescentes Rosa26-loxP-eGFP croisées avec le fibroblaste cardiaque exprimant la ligne knock-in Tcf21-MerCreMer. Cette technique a été employée pour observer la dynamique de localisation de fibroblaste dans tout le ventricule gauche adulte entier chez les souris saines et dans les modèles de souris fibrotiques de maladie cardiaque. Intéressant, dans un modèle de blessure, on a observé des modèles uniques des fibroblastes cardiaques dans le coeur blessé de souris qui a suivi des bandes des fibres enveloppées dans la direction contractile. Dans les modèles de dommages ischémiques, la mort de fibroblaste s’est produite, suivie du repeuplement de la zone frontière d’infarctus. Collectivement, cette technique de clarification des tissus cardiaques raffinée et ce système d’imagerie numérisé permettent la visualisation 3D des fibroblastes cardiaques dans le cœur sans les limitations de l’échec de pénétration des anticorps ou les problèmes précédents entourant la fluorescence perdue due au traitement des tissus.
Introduction
Bien que les cardiomyocytes comportent la plus grande fraction de volume dans le coeur, les fibroblastes cardiaques sont plus abondants et sont en critique impliqués en réglant les dispositifs structuraux et réparateurs de ligne de base de cet organe. Les fibroblastes cardiaques sont fortement mobiles, mécaniquement sensibles, et phénotypiquement s’étendant selon l’ampleur de leur activation. Les fibroblastes cardiaques sont nécessaires pour maintenir des niveaux normaux de matrice extracellulaire (ECM), et trop peu ou trop de production d’ECM par ces cellules peut conduire à la maladie1,2,3. Compte tenu de leur importance dans la maladie, les fibroblastes cardiaques sont devenus un sujet de recherche de plus en plus important pour identifier de nouvelles stratégies de traitement, en particulier en essayant de limiter la fibrose excessive4,5,6,7. En cas de blessure, les fibroblastes s’activent et se différencient en un type de cellule plus synthétique connu sous le nom de myofibroblaste, qui peut être prolifératif et sécrète un ECM abondant, ainsi que d’avoir une activité contractile qui aide à remodeler les ventricules.
Alors que les fibroblastes cardiaques ont été largement évalués pour leurs propriétés dans les cultures 2-D6,8,9,10,beaucoup moins est compris de leurs propriétés et dynamiques dans le cœur vivant 3-D, soit à la ligne de base ou avec la stimulation de la maladie. Ici, une méthode raffinée a été décrite pour effacer le tissu du cœur de souris adulte tout en maintenant la fluorescence des fibroblastes marqués avec un système de rapporteur génétique Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Au sein du cœur, Tcf21 est un marqueur relativement spécifique des fibroblastes quiescents4. Une fois que le tamoxifène est administré pour activer la protéine MerCreMer inductible, pratiquement tous les fibroblastes tranquilles exprimeront en permanence la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) du locus Rosa26, ce qui permet leur suivi in vivo.
De nombreux protocoles de nettoyage des tissus bien établis existent, dont certains ont été appliqués au cœur11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux réactifs utilisés dans différents protocoles de nettoyage des tissus se sont avérés étancher les signaux de fluorescenceendogènes 18. De plus, le cœur adulte est difficile à effacer en raison des protéines abondantes contenant un groupe d’hèmes qui génèrent une autofluorescence19. Par conséquent, le but de ce protocole était de préserver la fluorescence de marqueur de fibroblaste avec l’inhibition simultanée de l’autofluorescence d’hème dans le coeur adulte blessé pour la visualisation 3D optimale in vivo12,13,14,16,17,20.
Les études précédentes tentant d’examiner le fibroblaste cardiaque in vivo ont employé des anticorps perfusés pour étiqueter ces cellules, bien que de telles études aient été limitées par la pénétration d’anticorps et la structure vasculaire cardiaque14,16,17,20. Bien que Salamon et al. aient montré un nettoyage tissulaire avec le maintien de la fluorescence neuronale topique dans le cœur néonatal, et que Nehrhoff et al. aient montré le maintien des cellules myéloïdes marquant la fluorescence, le maintien de la fluorescence endogène à travers toute la paroi ventriculaire n’a pas encore été démontré, y compris la visualisation des fibroblastes cardiaques adultes au départ ou après une blessure13,20. Ce protocole d’élimination des tissus affine un mélange de protocoles précédents basés sur la méthode CLARITY (imagerie rigide acrylamide-hybridée clairement échangée par les lipides/ hydrogel tissulaire compatible avec l’hybridation in situ) et le PEGASOS (système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG)). Ce protocole raffiné a permis un examen plus robuste des fibroblastes cardiaques dans le coeur de souris à la ligne de base et de la façon dont ils répondent à différents types de dommages. Le protocole est simple et reproductible et aidera à caractériser le comportement des fibroblastes cardiaques in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente une méthode raffinée pour le dégagement de tissu qui tient compte de la visualisation des fibroblastes cardiaques in vivo, à la ligne de base et après des dommages, pour caractériser et mieux comprendre des fibroblastes dans le coeur de souris. Ce protocole amélioré répond aux limites des protocoles existants de nettoyage des tissus qui ont tenté d’identifier des types de cellules spécifiques dans le cœur adulte ou néonatal12,13,</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le CCHMC Confocal Imaging Core pour son aide et ses conseils dans le développement de ce modèle, ainsi que Matt Batie de Clinical Engineering pour la conception de toutes les pièces imprimées en 3D. Demetria Fischesser a bénéficié d’une subvention de formation des National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) et Jeffery D. Molkentin a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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