Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen
Summary
Eine verfeinerte Methode der Gewebereinigung wurde entwickelt und auf das erwachsene Mausherz angewendet. Diese Methode wurde entwickelt, um dichtes, autofluoreszierendes Herzgewebe zu beseitigen und gleichzeitig die markierte Fibroblastenfluoreszenz aufrechtzuerhalten, die einer genetischen Reporterstrategie zugeschrieben wird.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und sind oft durch erhöhte Herzfibrose gekennzeichnet, die zu einer erhöhten ventrikulären Steifigkeit mit veränderter Herzfunktion führen kann. Dieser Anstieg der herzventrikulären Fibrose ist auf die Aktivierung von ansässigen Fibroblasten zurückzuführen, obwohl nicht gut verstanden ist, wie diese Zellen innerhalb des 3-dimensionalen (3-D) Herzens, zu Beginn oder nach der Aktivierung funktionieren. Um zu untersuchen, wie Fibroblasten zu Herzerkrankungen und ihrer Dynamik im 3D-Herzen beitragen, wurde eine verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigungs- und Bildgebungsmethode entwickelt, die fluoreszierend markierte Herzfibroblasten im gesamten Mausherz zeigt. Geweberesidente Fibroblasten wurden genetisch mit Rosa26-loxP-eGFP floreszierenden Reportermäusen markiert, die mit der kardialen Fibroblasten-exprimierenden Tcf21-MerCreMer-Knock-in-Linie gekreuzt wurden. Diese Technik wurde verwendet, um die Fibroblastenlokalisierungsdynamik im gesamten linken Ventrikel des Erwachsenen bei gesunden Mäusen und in fibrotischen Mausmodellen für Herzerkrankungen zu beobachten. Interessanterweise wurden in einem Verletzungsmodell einzigartige Muster von Herzfibroblasten im verletzten Mausherz beobachtet, die Bändern von umwickelten Fasern in kontraktiler Richtung folgten. In ischämischen Verletzungsmodellen trat der Fibroblastentod auf, gefolgt von einer Wiederbesiedlung aus der Infarktgrenzzone. Zusammen ermöglicht diese verfeinerte Kardgewebeklärtechnik und das digitalisierte Bildgebungssystem eine 3D-Visualisierung von Herzfibroblasten im Herzen ohne die Einschränkungen von Antikörperpenetrationsversagen oder früheren Problemen im Zusammenhang mit verlorener Fluoreszenz aufgrund von Gewebeverarbeitung.
Introduction
Obwohl Kardiomyozyten die größte Volumenfraktion im Herzen ausmachen, sind Herzfibroblasten reichlich vorhanden und entscheidend an der Regulierung der strukturellen und reparativen Grundmerkmale dieses Organs beteiligt. Herzfibroblasten sind sehr mobil, mechanisch ansprechend und phänotypisch abhängig vom Ausmaß ihrer Aktivierung. Herzfibroblasten sind notwendig, um normale Spiegel der extrazellulären Matrix (ECM) aufrechtzuerhalten, und zu wenig oder zu viel ECM-Produktion durch diese Zellen kann zu Krankheiten führen1,2,3. Angesichts ihrer Bedeutung bei Krankheiten sind Herzfibroblasten zu einem immer wichtigeren Untersuchungsthema geworden, um neue Behandlungsstrategien zu identifizieren, insbesondere bei dem Versuch, übermäßige Fibrose zu begrenzen4,5,6,7. Nach einer Verletzung aktivieren und differenzieren sich Fibroblasten in einen synthetischeren Zelltyp, der als Myofibroblast bekannt ist, der proliferativ sein und reichlich ECM absondern kann, sowie eine kontraktile Aktivität aufwies, die hilft, die Ventrikel umzugestalten.
Während herzfibroblasten in 2-D-Kulturen 6,8 ,9,10umfassend auf ihre Eigenschaften und Dynamiken im3D-lebendenHerzen untersucht wurden, wird viel weniger über ihre Eigenschaften und Dynamik im 3D-lebenden Herzen verstanden, entweder zu Beginn oder bei Krankheitsstimulation. Hier wurde eine verfeinerte Methode beschrieben, um das erwachsene Mausherz zu klären und gleichzeitig die Fluoreszenz von Fibroblasten aufrechtzuerhalten, die mit einem Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer-Genreportersystem markiert sind. Innerhalb des Herzens ist Tcf21 ein relativ spezifischer Marker für ruhendierende Fibroblasten4. Nachdem Tamoxifen verabreicht wurde, um das induzierbare MerCreMer-Protein zu aktivieren, exprimieren im Wesentlichen alle ruhend ruhenden Fibroblasten dauerhaft ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) aus dem Rosa26-Locus, was ihre Verfolgung in vivo ermöglicht.
Es gibt zahlreiche gut etablierte Gewebereinigungsprotokolle, von denen einige auf das Herz11 , 12,13,14,15,16,17angewendet wurden . Es wurde jedoch festgestellt, dass viele der Reagenzien, die in verschiedenen Gewebereinigungsprotokollen verwendet werden, endogene Fluoreszenzsignale abschrecken18. Darüber hinaus ist das erwachsene Herz aufgrund der reichlich vorhandenen Hämgruppen-haltigen Proteine, die Autofluoreszenz erzeugen, schwer zu klären19. Daher war das Ziel dieses Protokolls, die Fibroblastenmarkerfluoreszenz mit der gleichzeitigen Hemmung der Häm-Autofluoreszenz im verletzten erwachsenen Herzen für eine optimale 3D-Visualisierung in vivo12,13,14,16,17,20zu erhalten.
Frühere Studien, die versuchten, den kardialen Fibroblasten in vivo zu untersuchen, verwendeten perfundierte Antikörper, um diese Zellen zu kennzeichnen, obwohl solche Studien durch Antikörperpenetration und kardiale Gefäßstruktur begrenzt waren14,16,17,20. Obwohl Salamon et al. eine Gewebereinigung mit Aufrechterhaltung der topischen neuronalen Fluoreszenz im neonatalen Herzen gezeigt haben und Nehrhoff et al. gezeigt haben, dass die Fluoreszenzmarkierung myeloischer Zellen erhalten bleibt, wurde die Aufrechterhaltung der endogenen Fluoreszenz durch die gesamte ventrikuläre Wand noch nicht nachgewiesen, einschließlich der Visualisierung von adulten Herzfibroblasten zu Beginn oder nach Verletzung13,20. Dieses Gewebereinigungsprotokoll verfeinert eine Mischung früherer Protokolle, die auf der CLARITY-Methode (klares lipidgetauschtes Acrylamid-hybridisiertes starres Imaging/Immunostaining/In-situ-Hybridisierungs-kompatibles Gewebehydrogel) und PEGASOS (Polyethylenglykol (PEG)-assoziiertes Lösungsmittelsystem) basieren. Dieses verfeinerte Protokoll ermöglichte eine robustere Untersuchung von Herzfibroblasten im Mausherz zu Studienbeginn und wie sie auf verschiedene Arten von Verletzungen reagieren. Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar und wird dazu beitragen, das Verhalten von Herzfibroblasten in vivo zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel stellt eine verfeinerte Methode zur Gewebereinigung vor, die die Visualisierung von Herzfibroblasten in vivo sowohl zu Studienbeginn als auch nach Verletzungen ermöglicht, um Fibroblasten im Mausherz zu charakterisieren und besser zu verstehen. Dieses erweiterte Protokoll adressiert Einschränkungen in bestehenden Gewebereinigungsprotokollen, die versucht haben, bestimmte Zelltypen im erwachsenen oder neonatalen Herzen zu identifizieren12,13,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem CCHMC Confocal Imaging Core für ihre Unterstützung und Anleitung bei der Entwicklung dieses Modells sowie Matt Batie von Clinical Engineering für das Design aller 3D-gedruckten Teile. Demetria Fischesser wurde durch ein Trainingsstipendium der National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) und Jeffery D. Molkentin durch das Howard Hughes Medical Institute unterstützt.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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