ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים
Summary
שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הן הגורם השכיח ביותר לתמותה ברחבי העולם, והוא מסומן לעתים קרובות על ידי פיברוזיס לב מוגבר שיכול להוביל נוקשות חדרית מוגברת עם תפקוד לב שונה. עלייה זו פיברוזיס חדרית לב נובעת הפעלה של פיברובלסטים תושב, אם כי איך תאים אלה פועלים בתוך הלב 3 מימדי (3-D), בבסיס או לאחר ההפעלה, אינו מובן היטב. כדי לבחון כיצד פיברובלסטים תורמים למחלות לב ולדינמיקה שלהם בלב תלת-ממדי, פותחה שיטת ניקוי והדמיה מעודנת המבוססת על CLARITY המציגה פיברובלסטים לבביים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך לב העכבר כולו. פיברובלסטים תושבי רקמות תויגו גנטית באמצעות רוזה26-loxP-eGFP עכברים כתב פלורסנט חצה עם פיברובלסט הלב המבטא Tcf21-MerCreMer לדפוק בקו. טכניקה זו שימשה כדי לבחון דינמיקה לוקליזציה fibroblast לאורך כל החדר השמאלי הבוגר בעכברים בריאים במודלים עכבר סיבי של מחלות לב. מעניין, במודל פציעה אחד, דפוסים ייחודיים של פיברובלסטים לב נצפו בלב העכבר הפצוע שעקב אחר רצועות של סיבים עטופים בכיוון הכווץ. במודלים של פגיעה איסכמית, התרחש מוות פיברובלסטי, ואחריו אכלוס מחדש מאזור הגבול האוטם. באופן קולקטיבי, טכניקת הבהרה זו של רקמת לב מעודנת ומערכת הדמיה דיגיטלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בלב ללא מגבלות של כשל חדירת נוגדנים או בעיות קודמות סביב פלואורסצנטיות אבודה עקב עיבוד רקמות.
Introduction
למרות cardiomyocytes מהווים את שבר הנפח הגדול ביותר בלב, fibroblasts לב הם בשפע יותר והם מעורבים באופן קריטי בוויסות התכונות המבניות הבסיסיות של איבר זה. פיברובלסטים לבביים הם ניידים מאוד, מגיבים מכנית, ופנוטיפיים הנעים בהתאם למידת ההפעלה שלהם. פיברובלסטים לב נחוצים כדי לשמור על רמות נורמליות של מטריצה חוץ תאית (ECM), וייצור ECM מעט מדי או יותר מדי על ידי תאים אלה יכול להוביל למחלה1,2,3. בהתחשב בחשיבותם במחלות, פיברובלסטים לב הפכו לנושא חשוב יותר ויותר של חקירה לקראת זיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניות, במיוחד בניסיון להגביל פיברוזיס מוגזם4,5,6,7. לאחר פציעה, fibroblasts להפעיל ולהבדיל לתוך סוג תא סינתטי יותר המכונה myofibroblast, אשר יכול להיות שגשוג להפריש ECM בשפע, כמו גם יש פעילות התכווצות המסייעת לשפץ את החדרים.
בעוד פיברובלסטים לב הוערכו בהרחבה עבור המאפיינים שלהם בתרבויות 2-D6,8,9,10, הרבה פחות מובן של המאפיינים שלהם ואת הדינמיקה בלב חי 3-D, או בבסיס או עם גירוי המחלה. כאן, שיטה מעודנת תוארה רקמה לנקות את לב העכבר הבוגר תוך שמירה על פלואורסצנטיות של fibroblasts שכותרתו עם Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer מערכת כתב גנטי. בתוך הלב, Tcf21 הוא סמן ספציפי יחסית של פיברובלסטים שקטים4. לאחר טמוקסיפן ניתנת כדי להפעיל את החלבון MerCreMer בלתי ניתן להסבר, למעשה כל fibroblasts רגיעה לצמיתות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מן הלוקוס Rosa26, אשר מאפשר המעקב שלהם vivo.
קיימים פרוטוקולים רבים לניקוי רקמות מבוססים, שחלקם הוחלו על הלב11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רבים של ריאגנטים המשמשים פרוטוקולים ניקוי רקמות שונים נמצאו להרוות אותות פלואורסצנטיים אנדוגני18. בנוסף, הלב הבוגר קשה לנקות בשל שפע של חלבונים המכילים קבוצת heme המייצרים שפעת אוטומטית19. לכן, מטרת פרוטוקול זה הייתה לשמר פלואורסצנטיות סמן פיברובלסט עם עיכוב בו זמנית של שפעת אוטומטית heme בלב הבוגר הפצוע להדמיה אופטימלית 3-D ב vivo12,13,14,16,17,20.
מחקרים קודמים שניסו לבחון את פיברובלסט הלב ב vivo השתמשו נוגדנים perfused לתייג תאים אלה, אם כי מחקרים כאלה היו מוגבלים על ידי חדירת נוגדנים ומבנה כלי דם לב14,16,17,20. למרות סלמון ואח ‘הראו ניקוי רקמות עם שמירה על פלואורסצנטיות עצבית אקטואלי בלב יילודים, ו Nehrhoff et al. הראו תחזוקה של פלואורסצנטיות סימון תאים מיאלואידיים, שמירה על פלואורסצנטיות אנדוגני דרך כל הקיר החדרי עדיין לא הוכח, כולל הדמיה של fibroblasts לב למבוגרים בבסיס או בעקבות פציעה13,20. פרוטוקול ניקוי רקמות זה מזקק תערובת של פרוטוקולים קודמים המבוססים על שיטת CLARITY (מערכת ממסים נוקשה אקרילאמיד-היברידית-היברידית/חיסונית/בהידרוגל רקמה תואמת איטו-הכלאה) ו- PEGASOS (מערכת ממס הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול מעודן זה התיר בדיקה חזקה יותר של פיברובלסטים לב בלב העכבר בבסיס וכיצד הם מגיבים לסוגים שונים של פציעה. הפרוטוקול הוא פשוט לשחזור יעזור לאפיין את ההתנהגות של פיברובלסטים לב vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג שיטה מעודנת לניקוי רקמות המאפשרת הדמיה של פיברובלסטים לבביים ב vivo, הן בבסיס הפציעה והן בעקבותיה, כדי לאפיין ולהבין טוב יותר פיברובלסטים בלב העכבר. פרוטוקול משופר זה מטפל במגבלות בפרוטוקולים קיימים לניקוי רקמות שניסו לזהות סוגי תאים ספציפיים בלב הבוגר או בילודים12</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר את CCHMC Confocal הדמיה ליבה על הסיוע וההדרכה שלהם בפיתוח של מודל זה, כמו גם מאט באטי מהנדסה קלינית עבור העיצוב של כל החלקים המודפסים 3D. דמטריה פישר נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (NHLBI, T32 HL125204) וג’פרי ד. מולקנטין נתמך על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
References
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
