Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti
Summary
Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.
Abstract
Le malattie cardiovascolari sono la causa più diffusa di mortalità in tutto il mondo ed è spesso contrassegnata da una fibrosi cardiaca aumentata che può portare a una maggiore rigidità ventricolare con funzione cardiaca alterata. Questo aumento della fibrosi ventricolare cardiaca è dovuto all’attivazione di fibroblasti residenti, anche se il modo in cui queste cellule operano all’interno del cuore tridimensionale (3D), al basale o dopo l’attivazione, non è ben compreso. Per esaminare come i fibroblasti contribuiscono alle malattie cardiache e alle loro dinamiche nel cuore 3D, è stato sviluppato un raffinato metodo di pulizia e imaging dei tessuti basato su CLARITY che mostra fibroblasti cardiaci etichettati fluorescentmente all’interno dell’intero cuore del topo. I fibroblasti residenti nei tessuti sono stati geneticamente etichettati utilizzando topi reporter florescenti Rosa26-loxP-eGFP incrociati con il fibroblasto cardiaco che esprime la linea di knock-in Tcf21-MerCreMer. Questa tecnica è stata utilizzata per osservare la dinamica di localizzazione dei fibroblasti in tutto il ventricolo sinistro adulto nei topi sani e nei modelli fibrotici di topo di malattie cardiache. È interessante notare che, in un modello di lesione, sono stati osservati modelli unici di fibroblasti cardiaci nel cuore del topo ferito che seguiva bande di fibre avvolte nella direzione della contrattile. Nei modelli di lesioni ischemiche si è verificata la morte dei fibroblasti, seguita dal ripopolamento dalla zona di confine infarto. Collettivamente, questa raffinata tecnica di chiar chiaritura del tessuto cardiaco e il sistema di imaging digitalizzato consentono la visualizzazione 3D dei fibroblasti cardiaci nel cuore senza i limiti del fallimento della penetrazione degli anticorpi o problemi precedenti che circondano la fluorescenza persa a causa della lavorazione dei tessuti.
Introduction
Sebbene i cardiomiociti costificheranno la più grande frazione di volume nel cuore, i fibroblasti cardiaci sono più abbondanti e sono coinvolti criticamente nella regolazione delle caratteristiche strutturali e riparatrici di base di questo organo. I fibroblasti cardiaci sono altamente mobili, meccanicamente reattivi e fenotipicamente variano a seconda dell’entità della loro attivazione. I fibroblasti cardiaci sono necessari per mantenere i normali livelli di matrice extracellulare (ECM), e una produzione troppo piccola o troppo di ECM da parte di queste cellule puòportare alla malattia 1,2,3. Data la loro importanza nella malattia, i fibroblasti cardiaci sono diventati un argomento di indagine sempre più importante verso l’identificazione di nuove strategie di trattamento, specialmente nel tentativo di limitare l’eccessiva fibrosi4,5,6,7. Al momento della lesione, i fibroblasti si attivano e si differenziano in un tipo di cellula più sintetica noto come miofibroblasto, che può essere proliferativo e secernore abbondante ECM, oltre ad avere un’attività contrattile che aiuta a rimodellare i ventricoli.
Mentre i fibroblasti cardiaci sono stati ampiamente valutati per le loro proprietà nelle colture 2D6,8,9,10, molto meno si comprende le loro proprietà e dinamiche nel cuore vivente 3D, sia al basale che con la stimolazione della malattia. Qui, è stato descritto un metodo raffinato per liberare il cuore del topo adulto mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettati con un sistema di reporter genetico Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. All’interno del cuore, Tcf21 è un marcatore relativamente specifico di fibroblasti quiescenti4. Dopo che il tamoxifene è stato somministrato per attivare la proteina MerCreMer induttiva, essenzialmente tutti i fibroblasti quiescenti esprimeranno permanentemente proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP) dal locus Rosa26, che consente il loro tracciamento in vivo.
Esistono numerosi protocolli di compensazione dei tessuti consolidati, alcuni dei quali sono stati applicati al cuore11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti dei reagenti utilizzati in diversi protocolli di compensazione dei tessuti sono stati trovati per spegnere i segnali di fluorescenza endogena18. Inoltre, il cuore adulto è difficile da cancellare a causa delle abbondanti proteine contenenti gruppo di eme che generano autofluorescenza19. Pertanto, l’obiettivo di questo protocollo era quello di preservare la fluorescenza marcatore fibroblasto con l’inibizione simultanea dell’autofluorescenza dell’eme nel cuore adulto ferito per una visualizzazione 3D ottimale in vivo12,13,14,16,17,20.
Studi precedenti che tentavano di esaminare il fibroblasto cardiaco in vivo impiegavano anticorpi perfusi per etichettare queste cellule, sebbene tali studi fossero limitati dalla penetrazione degli anticorpi e dalla strutturavascolare cardiaca 14,16,17,20. Sebbene Salamon et al. Questo protocollo di compensazione dei tessuti affina una miscela di protocolli precedenti basati sul metodo CLARITY (sistema solvente rigido ibrido con acrilammide (PEG) e PEGASOS (sistema solvente associato al polietilene glicole (PEG). Questo raffinato protocollo ha permesso un esame più robusto dei fibroblasti cardiaci nel cuore del topo al basale e di come rispondono a diversi tipi di lesioni. Il protocollo è semplice e riproducibile e aiuterà a caratterizzare il comportamento dei fibroblasti cardiaci in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un metodo raffinato per la pulizia dei tessuti che consente la visualizzazione di fibroblasti cardiaci in vivo, sia al basale che a seguito di lesioni, per caratterizzare e comprendere meglio i fibroblasti nel cuore del topo. Questo protocollo avanzato affronta le limitazioni nei protocolli di compensazione dei tessuti esistenti che hanno tentato di identificare tipi di cellule specifiche nel cuore adulto o neonatale12,13,<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il CCHMC Confocal Imaging Core per la loro assistenza e guida nello sviluppo di questo modello, nonché Matt Batie di Clinical Engineering per la progettazione di tutte le parti stampate in 3D. Demetria Fischesser è stata sostenuta da una borsa di formazione del National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin è stata sostenuta dall’Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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