健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング
Summary
組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。
Abstract
心血管疾患は、世界中で最も一般的な死亡率の原因であり、しばしば心臓機能の変化と心室の剛性の増加につながる可能性がある高められた心臓線維症によってマークされています。心室線維症のこの増加は、常駐線維芽細胞の活性化によるもので、これらの細胞が3次元(3-D)心臓内でどのように動作するかは、ベースラインまたは活性化後に、よく理解されていない。線維芽細胞が3D心臓における心臓病とそのダイナミクスにどのように寄与するかを調べるために、マウス心臓全体の蛍光標識心臓線維芽細胞を示す洗練されたCLARITYベースの組織クリアリングおよびイメージング法が開発されました。組織常駐線維芽細胞は、Tcf21-MerCreMerノックインラインを発現する心臓線維芽細胞と交差するRosa26-loxP-eGFPフローレストレポーターマウスを使用して遺伝的に標識した。この技術は、健康なマウスおよび心臓病の線維化マウスモデルにおける成人左心室全体にわたる線維芽細胞局在化ダイナミクスを観察するために使用された。興味深いことに、1つの傷害モデルでは、収縮方向に包まれた繊維のバンドに続く損傷したマウス心臓で心臓線維芽細胞のユニークなパターンが観察された。虚血性傷害モデルでは、線維芽細胞死が起こり、続いて梗塞境界領域からの再集団化が起こった。総称して、この精製された心臓組織の明確化技術およびデジタル化された画像化システムは、抗体の侵入の失敗または組織処理による失われた蛍光を取り巻く以前の問題の制限なしに心臓の心臓線維芽細胞を3D視覚化することを可能にする。
Introduction
心筋細胞は心臓の最大の体積分率を含むが、心臓線維芽細胞はより豊富であり、この器官のベースライン構造および修復特徴の調節に重大に関与する。心臓線維芽細胞は、移動性が高く、機械的に応答性が高く、その活性化の程度に応じて典型的に範囲が広がっています。心臓線維芽細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の正常なレベルを維持するために必要であり、これらの細胞によるあまりにも少ないまたは多すぎるECM産生は、疾患1、2、3につながる可能性がある。心臓病における彼らの重要性を考えると、心臓線維芽細胞は、特に過剰な線維症4、5、6、7を制限しようとする新しい治療戦略を特定するための調査のますます重要なトピックとなっている。傷害時に、線維芽細胞は活性化し、筋線維芽細胞として知られているより合成細胞タイプに分化し、増殖し、豊富なECMを分泌し、心室を改造するのに役立つ収縮活性を有する。
心臓線維芽細胞は、2次元培養6、8、9、10においてその特性について広範囲に評価されてきたが、ベースラインまたは疾患刺激で、3次元の生きている心臓におけるその特性およびダイナミクスについてはるかに少なく理解されている。ここで、細胞の線維芽細胞の蛍光を維持しつつ、成人マウス心臓を組織クリアする精製方法が記載されている。心臓の中で、Tcf21は静止線維芽細胞4の比較的特異的なマーカーである。タモキシフェンが誘導可能なMerCreMerタンパク質を活性化するために与えられた後、本質的にすべての静止線維芽細胞は永久に生体内での追跡を可能にするRosa26遺伝子座から強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するであろう。
多数の確立された組織クリアプロトコルが存在し、そのうちのいくつかは心臓11、12、13、14、15、16、17に適用されている。しかし、異なる組織クリアプロトコルで使用される試薬の多くは、内因性蛍光信号18をクエンチすることが発見されている。さらに、成人心臓は、自己蛍光19を生成する豊富なヘム群含有タンパク質のためにクリアすることが困難である。したがって、このプロトコルの目標は、ビボ12、13、14、16、17、20における最適な3D可視化のために、負傷した成人心臓におけるヘム自己蛍光の同時阻害と共に線維芽細胞マーカー蛍光を維持することであった。
インビボで心臓線維芽細胞を調べようとする以前の研究は、これらの細胞を標識するために浸透抗体を採用したが、そのような研究は抗体の浸透および心血管構造14、16、17、20によって制限された。サラモンらは、新生児心臓における局所神経蛍光の維持と組織のクリアを示しているが、Nehrhoffらは骨髄細胞をマーキングする蛍光の維持を示しているが、心室壁全体を通る内因性蛍光の維持は、ベースラインまたは傷害後の成人心臓線維芽細胞の視覚化を含めて、まだ実証されていない。この組織クリアリングプロトコルは、CLARITY法(透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイドリジジッドイメージング/イムノステイン/イン・シチュハイブリダイゼーション適合組織ヒドロゲル)およびPEGASOS(ポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム)に基づいて、以前のプロトコルの混合物を精製します。この洗練されたプロトコルは、ベースラインでマウス心臓の心臓線維芽細胞のより堅牢な検査を可能にし、それらが異なるタイプの傷害にどのように反応するかの。プロトコルは簡単で再現可能であり、生体内の心臓線維芽細胞の挙動を特徴付けるのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、ベースラインと次の傷害の両方で生体内の心臓線維芽細胞を視覚化し、マウス心臓の線維芽細胞を特徴付け、よりよく理解することを可能にする組織クリアリングのための洗練された方法を提示する。この強化されたプロトコルは、成人または新生児心臓12、13、14、16、17、20の特定の細胞タイプを同定しよ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、CCHMC共焦点イメージングコアが、このモデルの開発における支援と指導を認め、臨床工学のマット・ベイティがすべての3Dプリント部品の設計を行うことを認めたいと考えています。デメトリア・フィシェッサーは国立衛生研究所(NHLBI、T32 HL125204)からの訓練助成金によって支えられ、ジェフリー・D・モルケンティンはハワード・ヒューズ医学研究所の支援を受けました。
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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