Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados
Summary
Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.
Abstract
La enfermedad cardiovascular es la causa más frecuente de mortalidad en todo el mundo y a menudo se caracteriza por una fibrosis cardíaca aumentada que puede conducir a un aumento de la rigidez ventricular con una función cardíaca alterada. Este aumento en fibrosis ventricular cardiaca es debido a la activación de fibroblastos residentes, aunque cómo estas células funcionan dentro del corazón de 3 dimensiones (3-D), en la línea de fondo o después de la activación, no se entienda bien. Para examinar cómo los fibroblastos contribuyen a la enfermedad cardíaca y su dinámica en el corazón 3-D, un método refinado del claro y de la proyección de imagen CLARIDAD-basado del tejido fue desarrollado que muestra los fibroblastos cardiacos fluorescente etiquetados dentro del corazón entero del ratón. Los fibroblastos residentes del tejido fueron etiquetados genético usando los ratones florescentes del reportero de Rosa26-loxP-eGFP cruzados con el fibroblasto cardiaco que expresaba la línea knock-in de Tcf21-MerCreMer. Esta técnica fue utilizada para observar dinámica de la localización del fibroblasto a través del ventrículo izquierdo adulto entero en ratones sanos y en modelos fibróticos del ratón de la enfermedad cardíaca. Interesante, en un modelo de lesión, los patrones únicos de fibroblastos cardiacos fueron observados en el corazón dañado del ratón que siguió las vendas de fibras envueltas en la dirección contráctil. En modelos isquémicos de lesión, ocurrió la muerte del fibroblasto, seguida por la repoblación de la zona fronteriza del infarto. Colectivamente, esta técnica de clarificación de tejido cardíaco refinado y sistema de imágenes digitalizado permite la visualización en 3-D de fibroblastos cardíacos en el corazón sin las limitaciones de la falla de penetración de anticuerpos o problemas anteriores que rodean la fluorescencia perdida debido al procesamiento de tejidos.
Introduction
Aunque los cardiomyocytes comprendan la fracción de volumen más grande del corazón, los fibroblastos cardiacos son más abundantes y están implicados críticamente en la regulación de las características estructurales y reparadoras de la línea de fondo de este órgano. Los fibroblastos cardiacos son altamente móviles, mecánicamente responsivos, y fenotípicamente que se extienden dependiendo del grado de su activación. Los fibroblastos cardíacos son necesarios para mantener los niveles normales de matriz extracelular (MEC), y muy poca o demasiada producción de MEC por estas células puede conducir a la enfermedad1,2,3. Dada su importancia en la enfermedad, los fibroblastos cardíacos se han convertido en un tema de investigación cada vez más importante hacia la identificación de nuevas estrategias de tratamiento, especialmente en el intento de limitar la fibrosis excesiva4,5,6,7. Tras la lesión, los fibroblastos se activan y se diferencian en un tipo de célula más sintética conocida como miofibroblasto, que puede ser proliferativa y secretar abundante ECM, así como tener actividad contráctil que ayuda a remodelar los ventrículos.
Mientras que los fibroblastos cardiacos se han evaluado extensivamente para sus propiedades en las culturas 2-D6,8,9,10,mucho menos se entiende de sus propiedades y dinámica en el corazón vivo 3-D, en la línea de fondo o con el estímulo de la enfermedad. Aquí, un método refinado se ha descrito para despejar el tejido del corazón adulto del ratón mientras que mantiene la fluorescencia de fibroblastos etiquetados con un sistema genético del reportero de Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro del corazón, Tcf21 es un marcador relativamente específico de fibroblastos quietos4. Después de que el tamoxifeno se administra para activar la proteína MerCreMer inducible, esencialmente todos los fibroblastos quietos expresarán permanentemente la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) del locus Rosa26, lo que permite su seguimiento in vivo.
Existen numerosos protocolos de limpieza de tejidos bien establecidos, algunos de los cuales se han aplicado alcorazón 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, se ha encontrado que muchos de los reactivos utilizados en diferentes protocolos de limpieza de tejidos apagan las señales endógenas de fluorescencia18. Además, el corazón adulto es difícil de despejar debido a las abundantes proteínas que contienen el grupo heme que generan autofluorescencia19. Por lo tanto, la meta de este protocolo era preservar fluorescencia del marcador del fibroblasto con la inhibición simultánea del autofluorescence del heme en el corazón adulto dañado para la visualización óptima 3-D in vivo12,13,14,16,17,20.
Estudios previos que intentaban examinar el fibroblasto cardíaco in vivo emplearon anticuerpos perfundidos para etiquetar estas células, aunque tales estudios estuvieron limitados por la penetración de anticuerpos y la estructura vascular cardíaca14,16,17,20. Aunque Salamon et al. han demostrado un claro tisular con mantenimiento de la fluorescencia neuronal tópica en el corazón neonatal, y Nehrhoff et al. han demostrado mantenimiento de las células mieloides que marcan la fluorescencia, aún no se ha demostrado el mantenimiento de la fluorescencia endógena a través de toda la pared ventricular, incluida la visualización de fibroblastos cardíacos adultos al inicio o después de una lesión13,20. Este protocolo de limpieza de tejidos refina una mezcla de protocolos anteriores basados en el método CLARITY (hidrgel tisular rígido de acrilamida hibridada por lípidos claros) y PEGASOS (polietilenglicol (PEG)-sistema de disolvente asociado). Este protocolo refinado permitió una examinación más robusta de fibroblastos cardiacos en el corazón del ratón en la línea de fondo y de cómo responden a diversos tipos de lesión. El protocolo es sencillo y reproducible y ayudará a caracterizar el comportamiento de los fibroblastos cardíacos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta un método refinado para el claro del tejido que permita la visualización de fibroblastos cardiacos in vivo, en la línea de fondo y lesión siguiente, para caracterizar y para entender mejor los fibroblastos en el corazón del ratón. Este protocolo mejorado aborda las limitaciones en los protocolos de limpieza de tejidos existentes que han intentado identificar tipos específicos de células en el corazón adulto o neonatal12,13,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A los autores les gustaría reconocer al CCHMC Confocal Imaging Core por su asistencia y orientación en el desarrollo de este modelo, así como a Matt Batie de Clinical Engineering por el diseño de todas las piezas impresas en 3D. Demetria Fischesser fue apoyada por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud , (NHLBI, T32 HL125204) y Jeffery D. Molkentin fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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