Сборка и эксплуатация акустофлюидного устройства для улучшенной доставки молекулярных соединений к клеткам
Summary
Этот протокол описывает сборку и эксплуатацию недорогого акустофлюидного устройства для быстрой молекулярной доставки к клеткам посредством сонопорации, индуцированной ультразвуковыми контрастными веществами.
Abstract
Эффективная внутриклеточная доставка биомолекул необходима для широкого спектра биомедицинских исследований и клеточных терапевтических применений. Ультразвукопосредовая сонопорация является новым методом быстрой внутриклеточной доставки биомолекул. Сонопорация возникает, когда кавитация газонаполненных микропузырьков образует переходные поры в близлежащих клеточных мембранах, что позволяет быстро поглощать биомолекулы из окружающей жидкости. Современные методы сонопорации клеток in vitro в суспензии ограничены медленной пропускной способностью, изменчивостью условий ультразвукового воздействия для каждой клетки и высокой стоимостью. Для устранения этих ограничений было разработано недорогое акустофлюидное устройство, которое интегрирует ультразвуковой преобразователь в жидкостное устройство на основе PDMS, чтобы индуцировать последовательную сонопорацию клеток, когда они протекают по каналам в сочетании с ультразвуковыми контрастными веществами. Устройство изготовлено с использованием стандартных методов фотолитографии для производства жидкостного чипа на основе PDMS. Ультразвуковой пьезодисковый преобразователь подключается к устройству и приводится в действие микроконтроллером. Сборка может быть интегрирована в 3D-печатный корпус для дополнительной защиты. Клетки и микропузырьки проталкиваются через устройство с помощью шприцевого насоса или перистальтического насоса, подключенного к трубам из ПВХ. Улучшенная доставка биомолекул к Т-клеткам человека и клеткам рака легких демонстрируется с помощью этой акустофлюидной системы. По сравнению с объемными подходами к лечению, эта акустофлюидная система увеличивает пропускную способность и снижает изменчивость, что может улучшить методы обработки клеток для биомедицинских исследований и производства клеточной терапии.
Introduction
Вирусные и невирусные платформы были использованы для улучшения молекулярной доставки к клеткам. Вирусная доставка (трансдукция) является распространенным методом, используемым в клеточной терапии, требующей геномной модификации. Ограничения с вирусной доставкой включают потенциальный вставной мутагенез, ограниченную трансгенную способность и нежелательную множественность инфекции1,2. Поэтому невирусные методы молекулярной доставки находятся в разработке для широкого спектра биомедицинских и исследовательских применений. Общие методы включают механические, электрические, гидродинамические или использование лазерной энергии для усиления поглощения биомолекул клетками 3. Электропорация является широко используемой невирусной молекулярной платформой доставки, которая обладает способностью индуцировать преходящую перфорацию в плазматической мембране для внутриклеточной доставки молекулярных соединений4,5,6,7,8,9. Однако преходящая перфорация плазматической мембраны представляет собой стохастический процесс, и поглощение молекул посредством электропорации обычно зависит от пассивной диффузии через переходные мембранные поры4,7,8.
Альтернативным методом является использование ультразвука для усиленной внутриклеточной молекулярной доставки посредством кавитации ультразвуковых контрастных веществ (т.е. газонаполненных микропузырьков). Кавитация микропузырьков индуцирует микропотоковые эффекты в окружающих средах, которые могут вызвать преходящую перфорацию близлежащих плазматических мембран («сонопорация»), что позволяет быстро внутриклеточным поглощением биомолекул через пассивные или активные транспортные механизмы10,11,12. Сонопорация является эффективным методом для быстрой молекулярной доставки к клеткам, но этот подход часто требует дорогостоящего оборудования и объемных методов обработки, которые ограничены более низкой пропускной способностью и более высокой изменчивостью в условиях ультразвукового воздействия13. Для устранения этих ограничений в настоящее время разрабатываются акустофлюидные устройства, которые обеспечивают последовательную сонопорацию клеток в суспензии.
Акустофлюидика является расширяющейся областью, которая объединяет ультразвуковые и микрофлюидные технологии для широкого спектра применений. Этот подход ранее использовался для разделения частиц путем применения непрерывной ультразвуковой энергии для индуцирования стоячих акустических волн в флюидных каналах14,15,16,17. Частицы сортируются по отношению к различным частям устройства на основе различных свойств, таких как размер частиц, плотность и сжимаемость относительно среды16. Акустофлюидные технологии также находятся в разработке, чтобы обеспечить быструю молекулярную доставку к различным типам клеток для исследовательских применений и производства клеточной терапии18. Недавно мы продемонстрировали улучшенную молекулярную доставку к эритроцитам с использованием акустофлюидного устройства19на основе PDMS. В акустофлюидной платформе можно манипулировать динамикой клеток и микросубблов, чтобы вызвать физические взаимодействия, которые позволяют улучшить доставку биомолекул. Эффективность и консистенция внутриклеточной молекулярной доставки потенциально может быть увеличена за счет оптимизации расстояния между клетками и микропузырьками.
Одно из важных применений акустофлюидно-опосредоточной сонопорации включает транспорт биомолекул в первичные Т-клетки человека. Иммунотерапия, основанная на переносе приемных Т-клеток, такая как терапия Т-клетками рецептора химерного антигена (CAR T), быстро появляется для лечения различных заболеваний, включая рак и вирусы, такие как ВИЧ20. Терапия CAR T была особенно эффективна у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), с полной частотой ремиссии 70-90%21. Однако производство Т-клеток для этих методов лечения обычно зависит от вирусной трансдукции, которая ограничена потенциальным инкруционным мутагенезом, длительным временем обработки и проблемами доставки негенетических биомолекул, таких как белки или малые молекулы1. Акустофлюидно-опосредованные молекулярные методы доставки могут потенциально преодолеть эти ограничения и улучшить производство Т-клеточной терапии.
Другое важное применение акустофлюидно-опосредоточной сонопорации включает внутриклеточную доставку консервантных соединений, таких как трегалоза, которые защищают клетки во время замораживания и высыхания. Трегалоза вырабатывается некоторыми организмами в природе и помогает им переносить замерзание и высыхание, защищая их клеточные мембраны22,23. Однако трегалоза не вырабатывается клетками млекопитающих и непроницаема для клеточных мембран млекопитающих. Поэтому эффективные методы молекулярной доставки, такие как сонопорация, необходимы для достижения достаточных внутриклеточных уровней трегалозы, необходимых для защиты внутренних клеточных мембран. Этот подход в настоящее время находится в разработке для сухого сохранения различных типов клеток.
Этот протокол предоставляет подробное описание сборки и работы относительно недорогой акустофлюидной системы, управляемой микроконтроллером. Ультразвуковые контрастные вещества используются для индуцирования сонопорации в жидких каналах и обеспечивают быструю молекулярную доставку к различным типам клеток, включая Т-клетки и раковые клетки. Эта акустофлюидная система может быть использована для различных исследовательских приложений, а также может быть полезна в качестве прототипа системы для оценки методов сонопорации для улучшения производственных процессов клеточной терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает сборку и работу недорогой акустофлюидной системы, которая улучшает внутриклеточную доставку биомолекул для исследовательских применений. Есть несколько важных факторов, которые следует учитывать при сборке и эксплуатации этой системы. Акустофлюидное устрой?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана финансированием Национального научного фонда (#1827521, #1827521, #1450370) и Национальных институтов здравоохранения (U01HL127518). Услуги фотолитографии были предоставлены Центром микро/нанотехнологий Луисвилльского университета.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
