Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un dispositif acoustofluidic à faible coût pour la livraison moléculaire rapide aux cellules par l’intermédiaire du sonoporation induit par des agents de contraste d’ultrason.
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Article de méthode
Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’administration intracellulaire efficace de biomolécules est nécessaire pour un large éventail de recherches biomédicales et d’applications thérapeutiques cellulaires. la sonoporation Ultrason-négociée est une technique émergente pour la livraison intracellulaire rapide des biomolécules. La sonoporation se produit lorsque la cavitation de microbulles remplies de gaz forme des pores transitoires dans les membranes cellulaires voisines, ce qui permet une absorption rapide des biomolécules du fluide environnant. Les techniques actuelles de sonoporation in vitro des cellules en suspension sont limitées par un débit lent, une variabilité des conditions d’exposition aux ultrasons pour chaque cellule et un coût élevé. Pour remédier à ces limitations, un dispositif acoustofluidique à faible coût a été développé qui intègre un transducteur à ultrasons dans un dispositif fluidique à base de PDMS pour induire une sonoporation cohérente des cellules lorsqu’elles circulent à travers les canaux en combinaison avec des agents de contraste à ultrasons. L’appareil est fabriqué à l’aide de techniques de photolithographie standard pour produire la puce fluidique à base de PDMS. Un transducteur de disque piézo-ultrasonore est fixé à l’appareil et piloté par un microcontrôleur. L’assemblage peut être intégré à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D pour une protection supplémentaire. Les cellules et les microbulles sont poussées à travers l’appareil à l’aide d’une pompe à seringue ou d’une pompe péristaltique connectée à un tube en PVC. L’administration améliorée des biomolécules aux lymphocytes T humains et aux cellules cancéreuses du poumon est démontrée avec ce système acoustofluidique. Comparé aux approches de traitement en vrac, ce système acoustofluidique augmente le débit et réduit la variabilité, ce qui peut améliorer les méthodes de traitement cellulaire pour les applications de recherche biomédicale et la fabrication de thérapies cellulaires.
Introduction
Des plateformes virales et non virales ont été utilisées pour améliorer la livraison moléculaire aux cellules. L’administration virale (transduction) est une technique couramment utilisée dans les thérapies cellulaires nécessitant une modification génomique. Les limites de l’administration virale comprennent la mutagenèse insertionnelle potentielle, la capacité transgénique limitée et la multiplicité indésirable de l’infection1,2. Par conséquent, des techniques d’administration moléculaire non virale sont en cours de développement pour un large éventail d’applications biomédicales et de recherche. Les techniqu....
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Protocole
Les dons de sang total ont été recueillis auprès de donneurs en bonne santé conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Louisville.
1. Fabrication d’un dispositif acoustofluidique
- Obtenir un photomasque avec un dessin en spirale concentrique contenant des canaux d’un diamètre de 500 μm. Un fichier CAO est fourni dans les fichiers supplémentaires à titre d’exemple. Un photomasque personnalisé peut être commandé auprès d’un fournisseur commercial ou modelé à l’aide d’un enregistreur de masques.
- Préparez un moule de la conception en spirale concentrique sur....
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Résultats
Une image du système acoustofluidique assemblé à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D est illustrée à la figure 1. Ce protocole produit un système acoustofluidic qui peut être employé pour augmenter la livraison moléculaire intracellulaire dans des variétés de cellule multiples utilisant des agents de contraste d’ultrason.
Graphique 2 démontre l’administration intracellulaire augmentée d’un composé fluorescent, fl.......
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Discussion
Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique à faible coût qui améliore l’administration intracellulaire de biomolécules pour des applications de recherche. Il existe plusieurs facteurs importants à prendre en compte lors de l’assemblage et de l’exploitation de ce système. Le dispositif acoustofluidique est fabriqué en PDMS, qui est un matériau biocompatible qui peut facilement être moulé avec des dimensions de canal cohérentes27. Les canaux de l’appareil peu.......
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Déclarations de divulgation
Les coauteurs MAM et JAK détiennent la propriété de DesiCorp, qui pourrait bénéficier financièrement des produits liés à cette recherche.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) et des National Institutes of Health (U01HL127518). Les services de photolithographie ont été fournis par le Centre de micro/nanotechnologie de l’Université de Louisville.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fabrication d’un dispositif acoustofluidique | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Sciences de la microscopie électronique | 69039-25 | |
| Réservoir microfluidique pour tube Falcon de 15 mL - S (port 2/4) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Lame de microscope | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (n° de cas.) | Le chlorosilane est très hazaradeux et inflammable. L’exposition provoque de graves brûlures et des lésions oculaires. |
| Tube en plastique souple en PVC Tygon (1/16 » ID, 1/8 » OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Code-barres) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Préparation d’agents de contraste à ultrasons | |||
| 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2- distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (gaz décafluorobutate) | FlouroMed | 355-25-9 (n° CAS) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamateurs ; | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| stéarate de polyoxyéthylène 40 | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (N° de commande) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Kit d’isolement de cellules Pan T, humain (cocktail d’anticorps à la biotine Pan T-Cell & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) ; | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (N° de commande) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| trieur de cellules magnétiques (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (N° de commande) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Préparation de cellules cancéreuses du poumon A549 | |||
| kit de dosage du tréhalose ; | Megazyme | K-TREH (Cat. Non.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Bleu de trypan (0,4 % en solution aqueuse Prêt à l’emploi, stérile) | VWR | 97063-702 (Cat. Non.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Références
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....
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Réimpressions et autorisations
