Imagerie en direct à haut débit des microcolonies pour mesurer l’hétérogénéité de la croissance et de l’expression des gènes

Résumé

Les phénotypes de croissance de levure sont précisément mesurés par l’imagerie time-lapse très parallèle des cellules immobilisées se développent dans les microcolonies. Simultanément, la tolérance au stress, l’expression des protéines et la localisation des protéines peuvent être surveillées, générant des ensembles de données intégrés pour étudier comment les différences environnementales et génétiques, ainsi que l’hétérogénéité de l’expression génique entre les cellules isogéniques, modulent la croissance.

Résumé

Des mesures précises de l’hétérogénéité entre les souches et à l’intérieur de la souche dans les taux de croissance microbienne sont essentielles pour comprendre les apports génétiques et environnementaux dans la tolérance au stress, la pathogénie et d’autres composantes clés de la condition physique. Ce manuscrit décrit un test au microscope qui suit environ 10⁵microcoloniesSaccharomyces cerevisiae par expérience. Après l’imagerie automatisée en accéléré de levure immobilisée dans une plaque multiwell, les taux de croissance de la microcolonie sont facilement analysés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image personnalisé. Pour chaque microcolonie, l’expression et la localisation des protéines fluorescentes et la survie du stress aigu peuvent également être surveillées. Cet essai permet une estimation précise des taux de croissance moyens des souches, ainsi qu’une mesure complète de l’hétérogénéité de la croissance, de l’expression des gènes et de la tolérance au stress au sein des populations clonales. 

Introduction

Les phénotypes de croissance contribuent de façon critique à la condition physique de levure. La sélection naturelle peut faire une distinction efficace entre les lignées dont les taux de croissance diffèrent par l’inverse de la taille effective de la population, qui peut dépasser 10⁸ individus¹. En outre, la variabilité des taux de croissance entre les individus au sein d’une population est un paramètre d’évolution pertinent, car il peut servir de base à des stratégies de survie telles que la^{couverture des paris 2,3,4,}

Protocole

1. Préparation de plaques randomisées (avant le jour de l’expérience)

1. Planifiez les souches et les conditions à tester avec l’analyse de croissance. À ce stade, assigner au hasard des souches et des conditions à n’importe quel puits.
   REMARQUE : Lors de l’examen de la configuration de la plaque, il est conseillé d’inclure plus d’une réplique par souche et état de croissance sur une seule plaque pour tenir compte du bruit bien apparenté dans les mesures. Voir Discussion pour plus de détails.
2. Calculez aléatoirement l’emplacement de chaque souche et l’état de l’environnement pour les répliques de plaques qui seront exécutés à des jours différents.

Résultats

La nouveauté de ce protocole est que le taux de croissance peut être calculé pour les cellules individuelles au sein d’une population en suivant leur croissance en microcolonies par imagerie en accéléré (figure 2A). Étant donné que les microcolonies poussent pendant de nombreuses heures de façon planaire en raison de la présence de concanavalin A, leurs zones peuvent être suivies tout au long de l’expérience, et un ajustement linéaire au changement dans le journal naturel de la région au fil.......

Discussion

Le protocole décrit ici est un test polyvalent qui permet de surveiller simultanément la croissance cellulaire et l’expression des gènes au niveau des microcolonies individuelles. La combinaison de ces deux modalités donne des idées biologiques uniques. Par exemple, des travaux antérieurs ont utilisé cet essai pour montrer une corrélation négative entre l’expression du gène TSL1 et le taux de croissance de la microcolonie dans les cellules isogéniques de type sauvage en mesurant les^{deux simulta.......}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
General Materials
500 mL Filtre à bouteilles .22 µ ; m Stérilisation PES, faible liaison protéique, avec col Fisher de 45 mm		CLS431154	utilisé pour filtrer le média
Plaques de culture tissulaire BD Falcon*, microtest à fond en U	Fisher	08-772-54	Tubes de culture à 96 puits utilisés pour congeler les cellules, pré-cultiver les cellules et dilutions
Seringues BD sans aiguille, 50 ml	Fisher	13-689-8	Utilisé pour filtrer le Concanavalin A
Costar Réservoirs de réactifs stériles jetables	Fisher	07-200-127	Réservoirs de réactifs utilisés pour pipeter des solutions avec pipette multicanaux
Ruban d’étanchéité en aluminium à puits thermométrique Costar	Fisher	07-200-684	Joint à plaque à 96 puits pour la précroissance et la congélation
Lingettes Kimwipes	Fisher	06-666A	peluches et sans électricité statique pour garder le fond de la plaque de microscope exempt de débris et d’égratignures
Filtres	à seringue NalgeneThermoFisher Scientific	199-2020	0,2 &mu ; taille des pores M, 25 mm de diamètre ; utilisé pour filtrer le concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD ; 2 % de glucose)			milieu de microscopie alternatif utilisé pour la précroissance et la croissance de la levure pendant la microscopie
Milieu complet synthétique (SC ; glucose à 2 %)			milieu de microscopie utilisé pour la précroissance et la croissance de la levure pendant la microscopie
Extrait de levure-peptone-dextrose (YEPD ; 2 % de glucose) croissance cellulaire moyenne			avant la congélation des plaques aléatoires
Microscopie Matériaux
Respirante-Easy membrane d’étanchéité	Millipore Sigma	Z380059-1PAK	membranes respirantes utilisées pour sceller la plaque pendant l’expérience de microscopie. À ce stade, les membranes respirantes sont recommandées car elles empêchent la condensation dans les puits et permettent d’obtenir de meilleures images microscopiques
Plaque de microscope Brooks 96-well plate en verre transparent	Dot Scientific	MGB096-1-2-LG-L
plaque de microscope Concanavalin A de canavalia ensiformis (haricot jack), poudre lyophilisée Millipore	Sigma	45-C2010-1G	Préparez 5 solutions de concanavaline A et congelez 5 ml de 5 concanavaline A dans des tubes coniques de 50 ml à -80 °C C
Souches utilisées
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132			Souches d’accumulation de mutations haploïdes dans un contexte de laboratoire, décrites dans Hall et Joseph 2010
EP026.2A-2C			Descendance de la souche ancestrale d’accumulation de mutations Hall et Joseph 2010, transformée avec YFR054c&Delta ;::Scw11P : :GFP
Equipment
Sonicateur Misonix S-4000 avec fixation			Sonicateur https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E avec système			Microscope inversé avec platine automatisée et système de mise au point automatique

sans à 96 broches de mise au point parfaite