成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング
Summary
酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。
Abstract
微生物の成長速度における菌株間および内の不均一性の正確な測定は、ストレス耐性、病原性、およびフィットネスの他の重要な構成要素への遺伝的および環境的な入力を理解するために不可欠です。この原稿は、実験ごとに約105 サッカロミセスセレビシエ の微小コロニーを追跡する顕微鏡ベースのアッセイを記述しています。マルチウェルプレートに固定化された酵母の自動タイムラプスイメージング後、マイクロコロニーの成長率はカスタム画像解析ソフトウェアで容易に解析できます。各マイクロコロニーについて、蛍光タンパク質の発現と局在化、急性ストレスの生存もモニタリングできます。このアッセイにより、株の平均成長率を正確に推定できるほか、クローン集団内の増殖、遺伝子発現、ストレス耐性の不均一性を総合的に測定できます。
Introduction
成長フェノタイプは酵母のフィットネスに重要に貢献します。自然選択は、有効人口規模の逆数によって異なる成長率を有する系統間を効率的に区別することができ、これは1個1の1を超える可能性がある。さらに、人口内の個体間の成長率の変動は、ベットヘッジ2、3、4、5、6などの生存戦略の基礎となる可能性があるため、進化的に関連するパラメータである。したがって、増殖表現型とその分布を極めて正確に測定できるアッセイは、微生物の研究にとって極めて重要です。ここで述べたマイクロコロニー成長アッセイは、実験ごとに〜105マイクロコロニーの個々の増殖速度測定を生成することができる。したがって、このアッセイは、酵母進化遺伝学とゲノミクスを研究するための強力なプロトコルを提供します。遺伝的に同一の単一細胞の集団内の変動が生成され、維持され、集団適合性7、8、9、10にどのように寄与するかをテストするのに特に適しています。
ここで説明する方法(図1)は、96または384ウェルガラス底板上の液体媒体に成長する細胞の周期的に捕捉された低倍率の明視野画像を使用して、マイクロコロニーへの成長を追跡する。細胞は、顕微鏡板の底部を覆うレクチン・コンカナジンAに付着し、二次元コロニーを形成する。マイクロコロニーは単層で成長するため、マイクロコロニー領域は細胞番号7と高い相関性を持つ。したがって、マイクロコロニーの成長率とラグタイムの正確な推定値は、各マイクロコロニーの面積の変化率を追跡するカスタム画像解析ソフトウェアで生成することができます。さらに、実験のセットアップは、これらのマイクロコロニーで発現する蛍光標識タンパク質の存在量および細胞内局在化を監視することができる。このマイクロコロニー成長アッセイからのデータのダウンストリーム処理は、カスタム分析または既存の画像解析ソフトウェア(画像処理容易(PIE)11)、低倍率、明視野画像からの堅牢なコロニー領域認識およびハイスループット成長解析のためのアルゴリズムによって達成され得る。
マイクロコロニー成長アッセイから得られた増殖率推定値は、多数の単一コロニー測定から生成されるため、非常に正確であり、合理的な規模の実験では、推定値自体よりも数桁小さい標準誤差が存在します。したがって、異なる遺伝子型、治療、または環境条件間の成長速度差を検出するアッセイのパワーは高い。マルチウェルプレート形式により、多くの異なる環境と遺伝子型の組み合わせを1回の実験で比較できます。株が構成的に異なる蛍光マーカーを発現する場合、それらは同じウェルで混合され、その後の画像分析によって区別され、ウェルバイウェルのデータの正規化を可能にすることによってさらに電力を増加させる可能性があります。
図1: プロトコルの概略図 このプロトコルは、実験プレートの調製と画像への細胞の調製である2つの主要なステップに従います。プレートのランダム化と細胞の増殖は、実験日の前に、そして実験日に至るまで行われるべきである。希釈時の各工程での細胞の繰り返し混合は、めっきまでの工程において必須であり、したがって、細胞希釈が完了した直後にめっきできるように、実験プレートを最初に準備することが推奨される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、細胞増殖と遺伝子発現を個々のマイクロコロニーのレベルで同時に監視することを可能にする汎用性の高いアッセイです。これら2つのモダリティを組み合わせることで、ユニークな生物学的洞察が得られます。例えば、以前の研究では、このアッセイを用いて、同時に7,10の両方を測定することにより、アイソジェニ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナオミ・ジヴ、サーシャ・レヴィ、双李は、このプロトコルの開発に貢献してくれたことに感謝し、共有機器のデビッド・グレシャム、ビデオ制作に協力してくれたマリッサ・ノールに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金R35GM118170によってサポートされました。
Materials
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
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