Definere programmet for maternal mRNA-oversettelse under in vitro modning ved hjelp av en enkelt Oocyte Reporter Assay
Summary
Denne protokollen beskriver en reporteranalyse for å studere reguleringen av mRNA-oversettelse i enkle oocytter under in vitro modning.
Abstract
Hendelser knyttet til oocytt kjernefysisk modning er godt beskrevet. Imidlertid er mye mindre kjent om molekylære veier og prosesser som foregår i cytoplasma som forberedelse til befruktning og oppkjøp av totipotens. Under oocyttmodning avhenger endringer i genuttrykk utelukkende av oversettelse og nedbrytning av mors budbringer-RNAer (mRNAer) i stedet for transkripsjon. Gjennomføring av oversettelsesprogrammet spiller derfor en nøkkelrolle i etableringen av oocyttutviklingskompetanse for å opprettholde embryoutvikling. Dette dokumentet er en del av et fokus på å definere programmet for mors mRNA-oversettelse som foregår under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen. I dette metodenotatet presenteres en strategi for å studere regulering av oversettelse av mål-mRNAer under in vitro oocyttmodning. Her er en Ypet-reporter smeltet sammen til 3’s uoversatte region (UTR) av genet av interesse og deretter mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylert mRNA-koding for mCherry for å kontrollere for injisert volum. Ved å bruke intervallmikroskopi for å måle reporterakkumulering, beregnes oversettelseshastigheter ved ulike overganger under oocyttmet meiotisk modning. Her er protokollene for oocyttisolasjon og injeksjon, tidsforløpopptak og dataanalyse beskrevet ved hjelp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR-reporter som eksempel.
Introduction
En fullvoksen pattedyr oocytt gjennomgår raske endringer i forberedelsen til befruktning og oppkjøp av totipotens. Disse endringene er avgjørende for å opprettholde embryonal utvikling etter befruktning. Selv om hendelsene knyttet til kjernefysisk modning er relativt godt beskrevet, er mye mindre kjent om molekylære prosesser og veier i oocyttcyttcytoplasma. I de siste stadiene av oocyttmodning er oocytter transkripsjonelt stille, og genuttrykk er helt avhengig av mRNA-oversettelse og nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som er kritisk for utviklingskompetanse, er derfor avhengig av et program for tidsbelastet oversettelse av langvarige mRNAer som har blitt syntetisert tidligere under oocyttvekst1,3. Som en del av et fokus på å definere dette programmet for mors mRNA-oversettelse utført under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen, presenterer denne artikkelen en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelsen av mål maternal mRNAer i enkle oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metoden klones den åpne leserammen YPet oppstrøms for 3′ UTR av transkripsjonen av interesse. Deretter blir mRNAer som koder denne reporteren mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylerte mRNAer som koder mCherry for å kontrollere for injisert volum. Reporter akkumulering måles under in vitro oocytt meiotisk modning ved hjelp av tidsforløpmikroskopi. Akkumuleringen av gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres av det platåede nivået av co-injisert mCherry. Etter datainnsamling beregnes oversettelseshastigheter for ulike tidsintervaller under in vitro oocytt meiotisk modning ved å beregne hellingen av kurven oppnådd ved kurvetilpasning.
Denne tilnærmingen gir et verktøy for å eksperimentelt bekrefte endringer i oversettelsen av utvalgte endogene mRNAer. I tillegg forenkler denne metoden karakterisering av regulatoriske elementer som kontrollerer oversettelse under oocytt meiotisk modning ved å manipulere cis-regulatoriske elementer i 3′ UTR for mål mRNAer4,5,6. Manipulering av poly (A) hale lengde gir også innsikt i adenylase / deadenylase aktivitet i oocytter5. Mutagenese av cis-fungerende elementer eller RNA immunoprecipitation kan brukes til å studere interaksjoner med cognate RNA bindende proteiner6,7. I tillegg kan denne metoden brukes til å identifisere viktige komponenter i oversettelsesprogrammet som er kritiske for oocyttutviklingskompetanse ved å måle mål 3′ UTR-oversettelse i modeller knyttet til redusert oocyttkvalitet 8,9,10. Dette metodepapiret presenterer et representativt eksperiment der denuderte oocytter av 21-dagers C57/BL6-mus har blitt mikroinjisert med en Ypet-reporter smeltet sammen til 3′ UTR av IL-7. Oppsettet og protokollen for oocyttinjeksjon, tidsforløpregistrering og dataanalyse er beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte metoden beskriver en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelse av mål mRNA ved ulike overganger under in vitro oocytt meiotisk modning. IL-7, en cytokin utgitt av oocytten som kan være involvert i oocyte-cumulus cellekommunikasjon8,13, ble valgt med det formål å beskrive denne metoden. IL-7 er kjent for å bli stadig mer oversatt under oocyttmodning8 og muliggjør god visualisering av…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello ble støttet av et stipend fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans ble støttet av et Rubicon-stipend fra Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
