Induzione del microstreaming mediante oscillazioni di bolle non sferiche in un sistema di levitazione acustica

Summary

Viene proposta una tecnica veloce e affidabile per controllare le oscillazioni di forma di una singola bolla acustica intrappolata che si basa sulla tecnica della coalescenza tra due bolle. Le oscillazioni della forma della bolla controllate da simmetria e allo stato stazionario consentono l’analisi del flusso di fluido generato in prossimità dell’interfaccia della bolla.

Abstract

Quando si trovano vicino a barriere biologiche, le microbolle oscillanti possono aumentare la permeabilità della membrana cellulare, consentendo l’internalizzazione di farmaci e geni. Osservazioni sperimentali suggeriscono che la permeabilizzazione temporanea di queste barriere può essere dovuta allo stress di taglio che viene esercitato sui tessuti cellulari dal microstreaming di cavitazione. Il microstreaming a cavitazione è la generazione di flussi di vortice che sorgono attorno a microbolle ad ultrasuoni oscillanti. Per produrre tali flussi di liquido, le oscillazioni delle bolle devono deviare dalle oscillazioni puramente sferiche e includere un’instabilità traslazionale o modi di forma. Gli studi sperimentali sui flussi indotti dalle bolle e sullo sforzo di taglio sulle superfici vicine sono spesso limitati nella loro portata a causa della difficoltà di catturare le deformazioni di forma delle microbolle in modo stabile e controllabile. Descriviamo il progetto di una camera a levitazione acustica per lo studio delle oscillazioni non sferiche controllate dalla simmetria. Tale controllo viene eseguito utilizzando una tecnica di coalescenza tra due bolle in avvicinamento in un campo ultrasonico sufficientemente intenso. Il controllo delle oscillazioni non sferiche apre la strada a un microstreaming a cavitazione controllata di una microbolla oscillante a superficie libera. Le telecamere ad alto frame rate consentono di indagare quasi simultaneamente la dinamica delle bolle non sferiche alla scala temporale acustica e il flusso del liquido su una scala temporale inferiore. È dimostrato che è possibile ottenere una grande varietà di modelli fluidi e che sono correlati al contenuto modale dell’interfaccia a bolle. Dimostriamo che anche le modalità di forma di ordine elevato possono creare modelli fluidi a grande distanza se la dinamica dell’interfaccia contiene diverse modalità, evidenziando il potenziale delle oscillazioni non sferiche per la somministrazione mirata e localizzata del farmaco.

Introduction

In medicina, un farmaco somministrato deve penetrare molti ostacoli nel sistema vivente prima di raggiungere gli obiettivi desiderati. Tuttavia, la maggior parte dei farmaci vengono rapidamente puliti dal flusso sanguigno. L’efficienza del targeting è bassa e non possono facilmente attraversare le membrane cellulari, portando a una somministrazione inefficace del farmaco. Attualmente, l’uso di microbolle in combinazione con gli ultrasuoni è stato proposto come metodo innovativo per la somministrazione non invasiva, precisa e mirata di farmaci e geni a tessuti e cellule patologici¹. In questo approccio, le microbolle possono svolgere un ruolo come vettori in cui i farmaci liberi vengono co-iniettati con una sospensione di bolle di gas o caricati sulla sua superficie. Le microbolle possono anche fungere da vettore locale per rifocalizzare l’energia degli ultrasuoni al fine di interagire con le cellule. Fondamentalmente, sotto l’esposizione agli ultrasuoni, le bolle si comprimono e si espandono in modo stabile, un regime chiamato cavitazione stabile che genera flussi di liquido e quindi stress da taglio sugli oggetti vicini. Le microbolle possono anche oscillare in modo non lineare ed espandersi fino al collasso, nel regime di cavitazione inerziale, producendo onde d’urto che si propagano radialmente dal sito di collasso². È stato dimostrato che la cavitazione, stabile o inerziale, aumenta la permeabilizzazione delle membrane cellulari e quindi migliora l’internalizzazione dei farmaci nella cellula³.

Nelle applicazioni terapeutiche, comprendere il meccanismo dell’interazione bolla-cellula è molto importante, ma ci sono diverse barriere, sia dal lato scientifico che tecnico, che impediscono alla nostra conoscenza di avanzare. In primo luogo, catturare la dinamica delle cellule in risposta a stimoli meccanici indotti da bolle è molto difficile⁴. Alla scala temporale acustica, le oscillazioni delle microbolle del primo ordine possono portare all’attivazione dei canali di membrana, facilitando il passaggio molecolare attraverso le interfacce biologiche. Ciò avviene attraverso l’oscillazione diretta della membrana cellulare, chiamata anche “massaggio cellulare”⁵. L’attivazione del canale a seguito di stress meccanico diretto è stata evidenziata utilizzando tecniche patch-clamp che hanno misurato le proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari durante e dopo l’esposizione agli ultrasuoni⁶. Misurare la dinamica cellulare indotta da bolle (cioè il campo completo di deformazione della membrana cellulare) alla scala temporale acustica, fornirebbe anche informazioni sulla soglia di espansione dell’area della membrana Δ A/ A necessaria per indurre i pori nella membrana cellulare⁷. La seconda barriera è il controllo del regime di collasso delle bolle per evitare la lisi cellulare indotta da microbolle. I collassi delle bolle e i microgetti indotti sono stati identificati come un meccanismo attraverso il quale avviene la perforazione della membrana ^8,9. Una volta permeabilizzata, la membrana cellulare si ripara attraverso l’autosigillatura del calcio dei doppi strati lipidici e la fusione delle vescicole intracellulari⁹. Il verificarsi di collassi di bolle può anche causare danni letali alla cellula e indurre effetti collaterali non necessari in quelli circostanti. In applicazioni sensibili come l’apertura della barriera emato-encefalica mediata da ultrasuoni, è generalmente accettato che i collassi delle bolle inerziali dovrebbero essere evitati¹⁰.

Pertanto, enormi sforzi sono attualmente dedicati alla progettazione di sequenze di emissione di ultrasuoni, accoppiati con il monitoraggio e il controllo della cavitazione passiva, al fine di garantire oscillazioni stabili delle microbolle¹¹. In questo regime stabile, è stato ipotizzato che le bolle stabilmente oscillanti svolgano un ruolo importante nell’innesco della permeabilizzazione della membrana promuovendo lo stress di taglio spazialmente mirato sulla membrana cellulare⁷. Lo sforzo di taglio deriva dai flussi di liquido creati in prossimità delle bolle oscillanti. Questi flussi liquidi sono chiamati microstreaming di cavitazione e, come accennato in precedenza, sono uno dei diversi possibili meccanismi responsabili di un maggiore assorbimento di molecole extracellulari. Quando si tratta di sospensione di bolle o cellule come i saggi di trasfezione biologica in vitro¹², la permeabilizzazione mediante microstreaming potrebbe essere molto più efficiente della permeabilizzazione mediante collasso di bolle. Questo può essere dimostrato da una semplice considerazione geometrica. Nelle sospensioni cellulari, la sonoporazione sarà efficiente se la maggior parte delle cellule sospese è sottoposta ad effetti meccanici sufficientemente grandi (che portano alla permeabilizzazione della membrana). È noto che i collassi delle bolle sono diretti lungo la direzione di rottura della simmetria isotropa, come l’asse bolla-parete¹³ o la bolla-bolla e la linea bolla-cella che uniscono il loro centro di massa¹⁴. Il microgetto prodotto è quindi un fenomeno spazialmente localizzato lungo un numero finito di linee che uniscono i centri della cellula e della bolla. A seconda della concentrazione di cellule e bolle, nonché della distanza tra cellule a bolla, questo effetto potrebbe non essere il più efficiente per permeabilizzare l’intero numero di cellule sospese. Al contrario, il microstreaming di cavitazione è un fenomeno che si verifica su una scala temporale lenta, con una grande espansione spaziale rispetto al raggio della bolla. Inoltre, il flusso di liquido è distribuito intorno alla bolla e può quindi avere un impatto su un numero maggiore di cellule, a un raggio molto lungo. Pertanto, comprendere il microstreaming di cavitazione generato attorno a una bolla oscillante è un prerequisito per controllare e quantificare lo stress di taglio indotto dalla bolla che viene applicato alle cellule.

Per fare ciò, un passo preliminare consiste nel controllare le oscillazioni sferiche e non sferiche di una bolla guidata da ultrasuoni, poiché i flussi di liquido generati sono indotti dal moto dell’interfaccia della bolla^15,16. In particolare, le oscillazioni di forma delle microbolle devono essere innescate e mantenute stabili. Inoltre, l’orientamento delle oscillazioni della forma della bolla deve essere controllato per analizzare correttamente la correlazione tra la dinamica dell’interfaccia della bolla e il modello di microstreaming indotto. Quando si riassume la letteratura esistente, è ovvio che i risultati sperimentali dettagliati del microstreaming indotto dalla cavitazione sono disponibili solo per le bolle attaccate a una superficie. Le microbolle attaccate a parete sono comunemente utilizzate per valutare accurate dinamiche di interfaccia e interazioni cellulari su scala micrometrica sotto un sistema di microscopia ultraveloce. Questa configurazione è terapeuticamente rilevante quando si considerano microbolle vibranti situate sulla membrana cellulare^17,18,19. Lo studio della bolla attaccata al substrato può tuttavia rendere più complicata l’analisi della dinamica delle bolle, in parte a causa della natura complessa della dinamica della linea di contatto²⁰ e dell’attivazione dei modi di forma asimmetrica²¹. Nelle applicazioni mediche e biologiche, le bolle che non sono attaccate a una parete si trovano comunemente in geometrie confinate come piccoli vasi. Ciò influisce in modo significativo sulla dinamica delle bolle e sulle instabilità della forma. In particolare, la presenza di una parete vicina sposta la soglia di pressione per la modalità forma innescando valori di pressione più bassi a seconda del numero della modalità forma e della dimensione della bolla²². La parete influisce anche sul microstreaming indotto dalla bolla con intensità possibilmente maggiore per il flusso prodotto²³.

Tra tutti i possibili scenari che le microbolle possono sperimentare (libere o attaccate, vicine a una parete, collassate o stabilmente oscillanti), ci proponiamo di indagare la dinamica non sferica di una singola bolla lontana da ogni confine. La configurazione sperimentale si basa su un sistema di levitazione acustica²⁴ in cui viene utilizzata un’onda ultrasonica stazionaria per intrappolare la bolla. Questo scenario è coerente con le applicazioni mediche in cui una raccolta di bolle e cellule sospese coesistono in una camera di sonotransfezione, per esempio. Nella misura in cui le bolle e le celle non sono troppo vicine, si presume che la presenza di una cella non influisca sulla dinamica dell’interfaccia delle bolle. Quando le cellule seguono le traiettorie ad anello del microstreaming indotto dalla cavitazione, si avvicinano ciclicamente e respingono dalla posizione della bolla e possiamo supporre che la presenza cellulare non influisca né sul modello di flusso né sulla sua velocità media. Inoltre, la dinamica non sferica e il microstreaming indotto da singole bolle lontane dal confine sono ben noti da un punto di vista teorico. Per collegare il flusso di liquido indotto dalla bolla alla dinamica del contorno della bolla, è necessario caratterizzare accuratamente la dinamica dell’interfaccia della bolla. Per fare ciò, è preferibile adattare la scala spazio-temporale negli studi sperimentali rispetto a quelli utilizzati nelle terapie in modo che l’acquisizione con le comuni telecamere ad alta velocità (inferiori a 1 milione di fotogrammi / secondo) sia possibile utilizzando grandi bolle eccitate a frequenze più basse. Quando si considerano bolle non rivestite, l’autofrequenza ω n di un dato modo _n è correlata alla dimensione della bolla come ²⁵. Questa relazione raggio-autofrequenza è leggermente modificata quando si considerano le bolle sgusciate²⁶, ma l’ordine di grandezza dell’autofrequenza ω_n rimane lo stesso. Pertanto, studiare bolle con raggi di equilibrio ~ 50 μm in un campo di ultrasuoni a 30 kHz è simile allo studio di bolle rivestite di raggi ~ 3 μm in un campo di 1,7 MHz, come proposto da Dollet et ^al.27. Sono quindi previsti numeri di modalità di forma simili e quindi modelli di microstreaming.

Per innescare oscillazioni non sferiche dell’interfaccia a bolla, è necessario superare una certa soglia di pressione dipendente dal raggio, come mostrato in Figura 1. Le tecniche sperimentali esistenti si basano sull’aumento della pressione acustica per innescare i modi superficiali (illustrati dal percorso (1) nella figura 1), sia mediante aumento graduale della pressione²⁸ o mediante eccitazione ad ampiezza modulata responsabile dell’insorgenza periodica e dell’estinzione dei modi superficiali²⁹. I principali svantaggi di queste tecniche sono (i) un orientamento casuale dell’asse di simmetria delle oscillazioni superficiali che non possono essere controllate per essere nel piano di imaging, (ii) una breve durata delle oscillazioni della forma della bolla che rende difficile l’analisi dei flussi di liquido indotti su scale temporali più ampie e (iii) il frequente innesco di modalità di forma instabili. Proponiamo una tecnica alternativa per attraversare la soglia di pressione ad una pressione acustica costante nella mappa raggio/pressione, come illustrato dal percorso (2) nella Figura 1. Per fare ciò, è necessario aumentare la dimensione della bolla in modo tale che si trovi nella zona di instabilità. Tale aumento viene eseguito con una tecnica di coalescenza a bolle. La coalescenza di due microbolle, inizialmente sfericamente oscillanti, viene sfruttata per creare una singola bolla deformata. Se la pressione acustica e la dimensione della bolla della bolla a coalescenza si trovano nella zona di instabilità, vengono attivate le modalità di superficie. Abbiamo anche evidenziato che la tecnica della coalescenza induce oscillazioni di forma stabili in un regime di stato stazionario, nonché un asse di simmetria controllato definito dal movimento rettilineo delle due bolle in avvicinamento. Poiché un’oscillazione della forma stabile è garantita per pochi minuti, l’analisi del flusso di fluido indotto dalla bolla è possibile seminando il mezzo liquido con microparticelle fluorescenti, illuminate da un sottile foglio laser. La registrazione del movimento delle microparticelle solide in prossimità dell’interfaccia della bolla consente di identificare il modello del flusso di fluido indotto³⁰. Il principio generale dell’innesco delle oscillazioni a forma di bolla, che portano a un flusso di fluido stabile nel tempo, è illustrato nella Figura 2.

Nel seguente protocollo, delineiamo i passaggi necessari per creare oscillazioni stabili della forma della bolla attraverso la tecnica della coalescenza e descriviamo le misurazioni del flusso del fluido. Ciò include la progettazione del sistema di levitazione acustica, la calibrazione acustica, la nucleazione delle bolle e la tecnica di coalescenza, la misurazione della dinamica dell’interfaccia delle bolle e del flusso del fluido circostante e l’elaborazione delle immagini.

Protocol

1. Progettazione della camera a levitazione acustica Progettare un serbatoio cubico otticamente trasparente (simile al PMMA) (bordo di 8 cm e spessore di 2,8 mm per faccia) con il modulo di geometria di un software di simulazione multifisica (Table of Materials). Inserire una superficie cilindrica (Ø = 35 mm) centrata sul fondo del serbatoio, per modellare il trasduttore ad ultrasuoni. Impostare le condizioni al contorno su zero pressione su ciascuna parete con uno spostame…

Representative Results

Una sequenza completa di coalescenza di bolle che porta a oscillazioni non sferiche stabili nel tempo, controllate dalla simmetria, è presentata nella Figura 9. La fase di avvicinamento di due bolle oscillanti sfericamente termina quando il sottile film liquido tra le due bolle si rompe. Vale la pena notare che, nell’ultima fase prima della coalescenza, le interfacce delle bolle si discostano dalla sfericità. Entrambe le bolle si allungano su una forma elli…

Discussion

La procedura presentata consiste nell’utilizzare la coalescenza delle bolle al fine di innescare oscillazioni di forma della bolla stazionarie e controllate dalla simmetria, consentendo lo studio del flusso di fluido a lungo termine indotto da queste oscillazioni. La sfida principale nella tecnica è il controllo delle oscillazioni non sferiche per una bolla intrappolata, lontano da qualsiasi confine.

La maggior parte delle tecniche esistenti proposte in letteratura si sono concentrate sulle b…

Materials

Aspherical lens	Thorlabs	AL4050	Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source	CNI	MLL6FN	DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LJ1277L1-A	lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LK1900L1	lens of focus 250 mm
Fluorescent particles	Duke Scientific	R700	Red polymer fluorescent microspheres
Function generator	Agilent	HP33120	Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera	Vision Research	Phantom v12.0	High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium	Carlo Erba	Water for analysis	Demineralized, undegassed water
Multiphysics software	Comsol	None	Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser	New Wave Research	Solo III-15	5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens	Thorlabs	N-BK7	lens of focus 125 mm
Spherical concave lens	Thorlabs	N-SF11	Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer	SinapTec	Custom-made	Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software	NIH	ImageJ	Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage	Newport	M-406	Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage	Edmund Optics	62-299	Vertical displacement stage with micrometric screw