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Biologie

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。

Abstract

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、数百から数千の連続登録された超構造画像の収集を可能にし、組織微小解剖学の前例のない3次元ビューを提供します。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質から恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。しかし、適切な組織製剤がなければ、細胞の超構造は、誤った結論や誤解を招く結論が導かれるような方法で変更することができます。さらに、画像は、樹脂組み込み生物学的サンプルのブロック面をスキャンすることによって生成され、これはしばしば対処しなければならない課題と考慮事項を提示します。「組織充電」と呼ばれるイメージング中のブロック内の電子の蓄積は、コントラストの喪失と細胞構造を理解できないことにつながる可能性があります。さらに、電子ビームの強度/電圧を上げたり、ビームスキャン速度を下げたりすると画像解像度が向上しますが、これはまた、樹脂ブロックを損傷し、イメージングシリーズの後続の画像を歪めるという不幸な副作用を持つことができます。ここでは、細胞の超構造を維持し、組織の充電を減少させる生体組織サンプルの調製のためのルーチンプロトコルを提示する。また、組織ブロックへのダメージを最小限に抑えた高品質のシリアル画像の迅速な取得に関する画像化に関する考慮事項も提供しています。

Introduction

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、1981年にレイトンによって最初に説明され、樹脂に埋め込まれた組織の薄い部分を切断して画像化できる内蔵のミクロトームで増強された走査型電子顕微鏡を作りました。残念ながら、技術的な制限は、生体組織などの非導電性サンプルが許容できないレベルの充電(組織サンプル内の電子蓄積)を蓄積したように、その使用を導電性試料に制限した。蒸発した炭素減らされたティッシュの充満で切り傷の間のブロック面をコーティングする間、この画像取得時間およびイメージ貯蔵は、当時のコンピュータ技術が装置によって作成された大きなファイルサイズを管理するのに不十分であったため、問題が残った。この方法論は、可変圧室2を搭載したSBF-SEMを用いて、2004年にデンクとホルストマンによって再検討された。これにより、サンプル内の充電を低減するイメージングチャンバに水蒸気を導入することができ、非導電性サンプルのイメージングは、画像解像度の損失とはいえ実行可能になります。組織調製法およびイメージング法のさらなる改善により、高真空を用いたイメージングが可能となり、SBF-SEMイメージングは、もはや、充電3、4、5、6、7、8、9を放散するために水蒸気に依存しなくなりました。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。

SBF-SEMは、3-5 nm10、11の小さな平面解像度で、何千もの連続登録電子顕微鏡画像の自動収集を可能にします。重金属を含浸させ、樹脂に埋め込まれた組織は、ダイヤモンドナイフを取り付けた超ミクロトームを含む走査型電子顕微鏡(SEM)内に配置される。平らな表面をダイヤモンドナイフで切断し、ナイフを引き込み、ブロックの表面を電子ビームでラスターパターンでスキャンして組織の超構造の画像を作成します。次に、ブロックは「z ステップ」と呼ばれる z 軸で指定された量 (例えば 100 nm) を上げ、プロセスが繰り返される前に新しいサーフェスがカットされます。このようにして、組織が切り取られると、画像の3次元(3D)ブロックが生成されます。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質からさらに恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。

SBF-SEMイメージングは主にブロック面の画像を形成するために後方散乱電子を使用するが、二次電子は、撮像プロセス12の間に生成される。二次電子は、ブロックから逃げない後方散乱型電子や一次ビーム電子と並んで蓄積し、ブロック面に局在する静電場につながる「組織充電」を生み出す。この電子蓄積は、画像を歪めたり、ブロックから放出される電子を発生させ、後方散乱検出器によって集められた信号に寄与し、信号対雑音比13を減少させる。組織の帯電のレベルは、電子線の電圧または強度を低減させることによって減少させることができるが、またはビームのドウェル時間を短縮するが、これは減少する信号対雑音比14をもたらす。低電圧または強度の電子ビームを使用する場合、またはビームが各ピクセル空間内に短期間だけ収まる場合、組織から放出される後方散乱電子が少なく、より弱い信号をもたらす電子検出器によって捕捉される。デンクとホルストマンは、チャンバーに水蒸気を導入することによってこの問題に対処し、それによって画像解像度を犠牲にしてチャンバーとブロック面の電荷を低減した。チャンバー圧力が10-100 Paの場合、電子ビームの一部が散乱して画像ノイズや分解能の損失を起こしますが、試料室ではイオンが生成され、サンプルブロック2内の電荷が中和します。サンプルブロック内の電荷を中和する方法は、撮像中にブロック面上に窒素の焦点ガス注入を使用する、またはプローブビーム集荷エネルギーを減少させ、6、7、15を集めた信号を増加させるためにSBF-SEM段階に負の電圧を導入する。ステージバイアスを導入するのではなく、チャンバー圧力や局在窒素注入をブロック表面への電荷蓄積を低減させ、より積極的な撮像設定16を可能にする樹脂ミックスにカーボンを導入することにより樹脂の導電率を高めることも可能である。以下の一般的なプロトコルは、2010年に発表されたDeerinckら.プロトコルの適応であり、高分解能画像取得3、17、18、19を維持しながら組織の充電を最小限に抑えるために有用であるとわかった組織準備およびイメージング方法論の変更をカバーしている。前述のプロトコルは組織処理と重金属含浸に焦点を当てていますが、このプロトコルはSBF-SEM研究に固有のイメージング、データ分析、および再構築ワークフローに関する洞察を提供します。当研究室では、このプロトコルは、角膜や前部構造を含む多種多様な組織にうまく、再現的に適用されています。 まぶた、涙液および硬直腺、失明および視神経、心臓、肺および気道、腎臓、肝臓、クレマスター筋肉、および大脳皮質/髄質、およびマウス、ラット、ウサギ、モルモット、魚、単層および層状細胞培養、豚、非ヒト霊長類、ヒト20、22、23小さな変更は特定の組織やアプリケーションにとって価値があるかもしれませんが、この一般的なプロトコルは、当社のコアイメージング機能のコンテキストで非常に再現性と有用性が証明されています。

Protocol

すべての動物は、視力および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究の研究声明およびヒューストン大学検眼動物取り扱いガイドラインに記載されているガイドラインに従って取り扱われました。すべての動物の手順は、彼らが取り扱われた機関によって承認されました:マウス、ラット、ウサギ、モルモット、および非ヒト霊長類の手順はヒューストン大学動物ケアと使用…

Representative Results

マウスコルネアこのプロトコルは、マウス角膜に広く適用されています。SBF-SEMイメージングを用いて、エラスチンフリーマイクロフィブリル束(EFMB)のネットワークが成体マウス角膜内に存在することが示された。以前は、このネットワークは胚性および出生後早期の発達中にのみ存在すると考えられていました。SBF-SEMは角膜全体に広範なEFMBネットワークを明らかにし、断面?…

Discussion

この方法論文の目的は、当社の研究室が高解像度のシリアル電子顕微鏡画像を確実にキャプチャすることを可能にした組織調製法とイメージング方法論を強調し、この結果につながる重要なステップと、SBF-SEMイメージングを行う際に起こり得る潜在的な落とし穴を指摘することです。このプロトコルを使用して成功するには、組織の適切な固定、サンプルへの重金属の含浸、充填樹脂の改質…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

サム・ハンロン博士、エブリン・ブラウン博士、マーガレット・ゴンド博士の優れた技術支援に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 EY-018239およびP30 EY007551(国立眼科研究所)の一部、一部はライオン視覚財団、一部はNIH 1R15 HD084262-01(国立小児保健人間開発研究所)によって支えられました。

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
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Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
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