A سريع الغذاء تفضيل المقايسة في دروسوفيليا
Summary
نقدم بروتوكولاً لـ فحص تغذية خيارين للذباب هذا الخضوع للتغذية سريع وسهل التشغيل، وهو مناسب ليس فقط للبحوث المختبرية الصغيرة النطاق، ولكن أيضا للشاشات السلوكية عالية الإنتاجية في الذباب.
Abstract
لتحديد الغذاء ذات القيمة الغذائية مع تجنب استهلاك العوامل الضارة، تحتاج الحيوانات إلى نظام ذوق متطور وقوي لتقييم بيئتها الغذائية. ذبابة الفاكهة، Drosophila الميلانوغاستر، هو كائن حي نموذج قابل للخل وراثيا التي تستخدم على نطاق واسع لفك الأسس الجزيئية والخلوية والجسية من تفضيل الغذاء. لتحليل تفضيل الطعام الطائر ، هناك حاجة إلى طريقة تغذية قوية. وصف هنا هو اختبار التغذية خيارين، والتي هي صارمة، وتوفير التكاليف، وسريعة. المقايسة هي بيتري الطبق القائم على ويشمل إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة تستكمل مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ويتبع فحص البطن من كل ذبابة من حساب مؤشر تفضيل. على النقيض من لوحات متعددة، كل طبق بيتري يأخذ فقط ~ 20 s لملء ويوفر الوقت والجهد. يمكن استخدام هذا الفحص الغذائي لتحديد ما إذا كان الذباب مثل أو يكره طعامًا معينًا.
Introduction
على الرغم من الاختلافات الهائلة في البنية التشريحية لأعضاء الذوق بين الذباب والثدييات ، فإن الاستجابات السلوكية للذباب للعديد من المواد اللذيذة تشبه بشكل لافت للنظر تلك الخاصة بالثدييات. على سبيل المثال، يفضل الذباب السكر1،2،3،4،5،6،7،8،الأحماض الأمينية9،10،وانخفاض الملح11،والتي تشير إلى المواد الغذائية، ولكن رفض الأطعمة المريرة12،13،14،15 التي هي غير مستساغة أو سامة. على مدى العقدين الماضيين، وقد ثبت الذباب أن كائن حي نموذج قيمة للغاية لتعزيز فهم العديد من الأسئلة الأساسية المتعلقة الإحساس بالذوق واستهلاك المواد الغذائية، بما في ذلك الكشف عن لذيذ، نقل طعم، طعم اللدونة، والتغذية تنظيم16،17،18،19،20. ومن اللافت للنظر أن عددا من الدراسات أظهرت أن تحويل الذوق وآليات الدائرة العصبية الكامنة الكامنة في إدراك الذوق مماثلة بين ذباب الفاكهة والثدييات. لذلك ، فإن ذبابة الفاكهة بمثابة كائن تجريبي مثالي ، مما يتيح للباحثين الكشف عن المفاهيم والمبادئ المحفوظة تطورًا التي تحكم اكتشاف الطعام واستهلاكه في المملكة الحيوانية.
للتحقيق في الإحساس بالطعم في الذباب ، من الأهمية بمكان إنشاء فحص سريع وصارم لقياس تفضيل الطعام بموضوعية. على مر السنين ، وطرق التغذية المختلفة ، مثل المقايسات على أساس صبغ11،12،13،21،22،23، و يطير proboscis تمديد استجابة المقايسة24، تغذية شعرية (CAFE) مقايسة25،26، ذبابة السائل الغذاء التفاعل عداد (FLIC) اختبار27، وغيرها من أساليب combinatorial وضعت لقياس كميا تفضيل الغذاء و / أو تناول الطعام للذباب الفاكهة28،29،30،31. واحدة من نماذج التغذية الشعبية هو صبغ القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية باستخدام إما لوحة microtiter متعددةويل12،21،32 أو ، كما هو موضح هنا ، طبق بيتري صغيرة11،22 كما غرفة التغذية. تم تصميم هذا الفحص بناءً على شفافية بطن الذبابة. خلال هذا الفحص ، يتم وضع الذباب في غرفة التغذية وتقديمه مع خيارين من الطعام ممزوجاً إما بصبغة حمراء أو صبغة زرقاء. بمجرد اكتمال الفحص ، تظهر البطن تطير حمراء أو زرقاء اعتمادًا على الطعام الذي استهلكوه.
كل من بيتري طبق ومجرّات التغذية متعددة المستويات القائمة على صبغة هي قوية للغاية وتسفر عن نفس النتائج تقريبا. باستخدام هذه المقايستين ، تم تحقيق العديد من الاكتشافات الهامة والاختراقات نحو فك رموز المستقبلات والخلايا المتنوعة للغاية المسؤولة عن استشعار أذواق الطعام والملمس الغذائي11،12،21،22،32،33. في المقايسة القائمة على الصبغة، خطوة تجريبية واحدة تتطلب وقتا طويلا وجهدا هو إعداد وتحميل الطعام في غرفة التغذية. للحد من إعداد الطعام ووقت التحميل ، تم تعديل هذه المقايسة عن طريق استبدال لوحة microtiter متعددة الويل بطبق بيتري صغير ، والذي ينقسم إلى قسمين متساويين. في المقايسة التي تعتمد على طبق بيتري، يتم إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة المكملة مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ثم يتم فحص البطن من كل ذبابة، ويتم حساب مؤشر تفضيل (PI).
هذا بيتري طبق القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية بأسعار معقولة وبسيطة وسريعة. يتطلب لوح واحد متعدد المستويات حوالي 110 s لملء، في حين أن كل طبق بيتري يأخذ فقط ~20 s. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الصفيحة المتعددة الآبار تتطلب إدخال كميات صغيرة من الأغذية إلى عدد كبير من الآبار الصغيرة (مثل 60 بئراً أو أكثر لكل صفيحة)، الأمر الذي يتطلب قدراً كبيراً من الدقة والاهتمام. وعلى العكس من ذلك، يتطلب المقايسة القائمة على طبق بيتري إجراءين فقط لكل لوحة. كما يمكن أن تنطوي على فحص التغذية عدد كبير من النسخ المتماثلة، مقايسة بيتري الطبق القائم يوفر كمية غير تماثل من الوقت والجهد. هذا الفحص يعطي نتائج مكافئة لتلك التي من المقايسة متعددة القائم على الويل وقد ثبت نجاحه في معالجة العديد من الأسئلة الأساسية في الإحساس بالذوق، بما في ذلك الملح طعم الترميز11، طعم اللدونة المعدلة من تجربة الغذاء22، والأساس الجزيئي للالمسيج الغذائي الإحساس33. وخلاصة القول، إن هذا الفحص القائم على خيارين من بيتري-طبق هو أداة قوية للتحقيق في كيفية إدراك الذباب للأوساط الغذائية الخارجية والداخلية لانتزاع سلوك التغذية المناسب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتضمن هذه الطريقة عدة خطوات هامة حيث يمكن أن تحدث مشاكل. أولاً، تأكد من أن الذباب يبتلع كمية كافية من الطعام لتوفير بيانات مستقرة. إذا كان الذباب يأكل بشكل سيئ ، تأكد من أن الذباب قد تم تجويعه لمدة 24 ساعة على الأقل ، وأن الوسائط التجريبية تحتوي على الحد الأدنى من تركيز السكروز (2 mM). لمزيد من ت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور تينغوي مي لمساعدته على تحسين فحص التغذية الذي يختاره خياران. كما يودون أن يشكروا صموئيل تشان ووايت كولميس على تعليقاتهما على المخطوطة. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R03 DC014787 (Y.V.Z.) وR01 DC018592 (Y.V.Z.) ومن قبل مؤسسة أمبروز مونيل.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Génétique. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Génétique. 208 (4), 1291-1309 (2018).
