Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Summary

Здесь представлен модифицированный метод TGA для оценки содержания лигнина в травянистой растительной биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования специфических тиоэфирных связей с лигнином и представляет собой преимущество перед методом Класона, поскольку он требует относительно небольшой выборки для оценки содержания лигнина.

Abstract

Лигнин является природным полимером, который является вторым наиболее распространенным полимером на Земле после целлюлозы. Лигнин в основном осаждается во вторичных клеточных стенках растений и представляет собой ароматический гетерополимер, в основном состоящий из трех монолигнолов со значительным промышленным значением. Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений, защищает от биотических и абиотических стрессов, а также в качестве кормов для животных, древесины и промышленных лигниновых продуктов. Точная оценка содержания лигнина имеет важное значение как для фундаментального понимания биосинтеза лигнина, так и для промышленного применения биомассы. Метод тиогликолевой кислоты (TGA) является высоконадежным методом оценки общего содержания лигнина в биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования тиоэфиров с бензиловым спиртом групп лигнина, которые растворимы в щелочных условиях и нерастворимы в кислых условиях. Общее содержание лигнина оценивается с использованием стандартной кривой, полученной из коммерческого бамбукового лигнина.

Introduction

Лигнин является одним из жизненно важных несущих компонентов клеточных стенок растений и вторым наиболее распространенным полимером на Земле^1. Химически лигнин представляет собой сшитый гетерополимер, состоящий из высокомолекулярных комплексных фенольных соединений, которые образуют естественный возобновляемый источник ароматических полимеров и синтеза биоматериалов^2,3. Этот природный полимер играет значительную роль в росте, развитии, выживании, механической поддержке, жесткости клеточных стенок, водном транспорте, минеральном транспорте, устойчивости к жилью, развитии тканей и органов, отложении энергии и защите от биотических и абиотических стрессов^4,5,6,7. Лигнин в основном состоит из трех различных монолигнолов: хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов, которые получены из фенилпропаноидного пути^8,9. Количество лигнина и состав мономеров варьируются в зависимости от вида растения, типа ткани/органа и различных стадий развития растений^10. Лигнин широко классифицируется на хвойный, лиственный и травяной лигнин на основе источника и монолигнольного состава. Древесина хвойных пород в основном состоит из 95% хвойного спирта с 4% п-кумарилового и 1% синапилового спиртов. Древесина лиственных пород имеет хвойный и синапиловый спирты в равных пропорциях, в то время как травяной лигнин состоит из различных пропорций хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов^11,12. Состав мономеров имеет решающее значение, поскольку он определяет силу лигнина, разложение и деградацию клеточной стенки, а также определяет молекулярную структуру, ветвление и сшивание с другими полисахаридами^13,14.

Исследования лигнина приобретают все большее значение в кормовой, текстильной промышленности, бумажной промышленности, а также для биоэтанола, биотоплива и биопродуктов из-за его низкой стоимости и высокой численности^15,16. Различные химические методы (например, ацетилбромид, кислотные детергенты, клазон и перманганатное окисление) наряду с инструментальными методами (например, спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (NIR), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия) были использованы для количественного определения лигнина^9,17. Методы анализа лигнина обычно классифицируются на основе электромагнитного излучения, гравиметрии и растворимости. Принцип, лежащий в основе оценки лигнина электромагнитным излучением, был основан на химическом свойстве лигнина, с помощью которого он поглощает свет на определенных длинах волн. Эти результаты были оценены на основе принципа, что лигнин обладает более сильным поглощением ультрафиолета, чем углеводы. В 1962 году Болкер и Сомервилл использовали гранулы хлорида калия для оценки содержания лигнина в древесине^18. Однако этот метод имеет недостатки в оценке содержания лигнина из травянистых образцов из-за наличия нелигниновых фенольных соединений и отсутствия соответствующего коэффициента вымирания. В 1970 году Фергус и Геринг обнаружили, что максимумы поглощения соединения гуаяцила и сирингила были на уровне 280 нм и 270 нм, что скорректировало проблему коэффициента вымирания метода Болкера и Сомервилля^19. Позже инфракрасная спектроскопия, высокочувствительный метод характеристики фенолов, также использовалась для оценки лигнина с небольшим количеством образцов биомассы растений. Одним из примеров такой технологии является диффузная рефлектная спектрофотометрия с преобразованием Фурье. Этот метод, однако, не имеет надлежащего стандарта, аналогичного УФ-методу^20. Позже содержание лигнина оценивали с помощью NIRS (ближняя инфракрасная спектроскопия) и ЯМР (ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия). Хотя у этих способов есть недостатки, они не изменяют химическую структуру лигнина, сохраняя его чистоту^20.

Гравиметрический метод Класона является прямым и наиболее надежным аналитическим методом для лигниновой оценки древесных стеблей. Основой для гравиметрической оценки лигнина является гидролиз/солюбилизация нелигниновых соединений и сбор нерастворимого лигнина для гравиметрии^21. В этом способе углеводы удаляют гидролизом биомассы с концентрированным_Н2SO₄ для извлечения остатка лигнина^20,22. Содержание лигнина, оцененное этим методом, известно как кислотный нерастворимый лигнин или лигнин Клазона. Применение метода Класона зависит от вида растения, типа ткани и типа клеточной стенки. Наличие переменных количеств нелигниновых компонентов, таких как дубильные вещества, полисахариды и белки, приводит к пропорциональным различиям в оценке содержания кислотного нерастворимого/растворимого лигнина. Следовательно, метод Класона рекомендуется только для оценки лигнина биомассы с высоким содержанием лигнина, такой как древесные стебли^17,23. Методы растворимости, такие как ацетилбромид (AcBr), нерастворимый в кислоте лигнин и тиогликолевая кислота (TGA), являются наиболее часто используемыми методами для оценки содержания лигнина из различных источников биомассы растений. Kim et al. установили два метода экстракции лигнина методом солюбилизации. Первый способ экстрагирует лигнин в виде нерастворимого остатка путем солюбилизации целлюлозы и гемицеллюлозы, в то время как второй способ разделяет лигнин в растворимой фракции, оставляя целлюлозу и гемицеллюлозу в качестве нерастворимого остатка^24.

Аналогичными методами, используемыми при оценке лигнина на основе растворимости, являются методы тиогликолевой кислоты (TGA) и ацетилбромида (AcBr)^25. Как методы TGA, так и методы ацетилбромида оценивают содержание лигнина путем измерения абсорбации солюбилизированного лигнина при 280 нм; однако метод AcBr разлагает ксиланы в процессе солюбилизации лигнина и показывает ложное увеличение содержания лигнина^26. Метод тиогликолата (TGA) является более надежным методом, так как он зависит от специфической связи с тиоэтерными группами бензилового спирта групп лигнина с TGA. Связанный с TGA лигнин осаждается в кислых условиях с использованием HCl, а содержание лигнина оценивается с использованием его абсорбции при 280 нм^27. Метод TGA имеет дополнительные преимущества: меньшую структурную модификацию, растворимую форму оценки лигнина, меньшую интерференцию от нелигниновых компонентов и точную оценку лигнина из-за специфической связи с TGA.

Этот метод TGA модифицирован на основе типа образца биомассы растений, используемого для оценки содержания лигнина. Здесь мы модифицировали и адаптировали быстрый метод TGA рисовых соломинок²⁷ к тканям хлопка для оценки содержания лигнина. Вкратце, высушенные порошкообразные образцы растений подвергали буферу солюбилизации белка и экстракции метанола для удаления белков и спирторастворимой фракции. Нерастворимый в спирте остаток обрабатывали TGA и осажденным лигнином в кислых условиях. Стандартная кривая лигнина была сгенерирована с использованием коммерческого бамбукового лигнина и получена линия регрессии (y = mx+c). Значение “x” использует средние значения поглощения лигнина при 280 нм, в то время как значения “m” и “c” были введены из линии регрессии для расчета неизвестной концентрации лигнина в образцах биомассы хлопковых растений. Этот метод делится на пять этапов: 1) подготовка образцов растений; 2) промывка проб водой и метанолом; 3) обработка гранул ТГА и кислотой с осаждением лигнина; 4) осаждение лигнина; и 5) подготовка стандартной кривой и оценка содержания лигнина в образце. Первые две фазы в основном сосредоточены на подготовке растительного материала, за которым следуют вода, PSB (буфер солюбилизации белка) и экстракция метанола для получения нерастворимого в спирте материала. Затем его обрабатывали TGA (тиогликолевой кислотой) и HCl с образованием комплекса с лигнином в третьей фазе. В конце HCl использовали для осаждения лигнина, который растворяли в гидроксиде натрия для измерения его абсорбции при 280 нм^28.

Protocol

1. Подготовка образцов растений Соберите двухмесячные растения хлопчатника из теплицы(Рисунок 1А). Аккуратно переверните горшки для растений, чтобы разделить почву и корни с неповрежденными боковыми корнями, рыхляя почву вокруг растения(рисунок 1B)…

Representative Results

Две различные экспериментальные линии хлопка сравнивались на наличие различий в содержании лигнина в разных тканях. Содержание экстрагированного лигнина в каждом образце измеряли при 280 нм и регистрировали его соответствующие значения поглощения. Средние значения абсорбции каждого …

Discussion

Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений и в последнее время широко изучается для применения в биотопливе, биоэнергетике и биопродуктах. Лигнин богат ароматическими соединениями, которые хранятся во всех сосудистых вторичных клеточных стенках растений. Он имеет нескольк?…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples