تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)
Summary
هنا، نقدم طريقة معدلة TGA لتقدير محتوى اللجنين في الكتلة الحيوية النباتية العشبية. تقدر هذه الطريقة محتوى اللجنين من خلال تشكيل روابط ثيوثير محددة مع اللجنين وتقدم ميزة على طريقة Klason ، لأنها تتطلب عينة صغيرة نسبيا لتقدير محتوى اللجنين.
Abstract
اللجنين هو البوليمر الطبيعي الذي هو البوليمر الثاني الأكثر وفرة على الأرض بعد السليلوز. يتم إيداع اللجنين بشكل رئيسي في جدران الخلايا الثانوية النباتية وهو heteropolymer العطرية تتألف في المقام الأول من ثلاثة monolignols مع أهمية صناعية كبيرة. يلعب اللجنين دورا هاما في نمو النباتات وتنميتها، ويحمي من الضغوط الحيوية والأبايوتية، وفي جودة العلف الحيواني والخشب ومنتجات اللجنين الصناعية. التقدير الدقيق لمحتوى اللجنين ضروري لكل من الفهم الأساسي والإدراك الحيوي لللجنين والتطبيقات الصناعية للكتلة الحيوية. طريقة حمض ثيوغليكوليك (TGA) هي طريقة موثوقة للغاية لتقدير إجمالي محتوى اللجنين في الكتلة الحيوية النباتية. تقدر هذه الطريقة محتوى اللجنين عن طريق تشكيل ثيويثرز مع مجموعات الكحول البنزيل من اللجنين ، والتي هي قابلة للذوبان في الظروف القلوية وغير قابلة للذوبان في الظروف الحمضية. يقدر إجمالي محتوى اللجنين باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه من اللجنين التجاري من الخيزران.
Introduction
اللجنين هو واحد من المكونات الحيوية الحاملة لجدران الخلايا النباتية وثاني أكثر البوليمرات وفرة على الأرض1. كيميائيا، اللجنين هو heteropolymer مترابطة تتكون من مركبات الفينولية المعقدة عالية الوزن الجزيئي التي تشكل مصدرا طبيعيا متجددا من البوليمرات العطرية وتوليف المواد الحيوية2،3. هذا البوليمر الطبيعي يلعب أدوارا هامة في نمو النبات، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة، والدعم الميكانيكي، وصلابة جدار الخلية، ونقل المياه، والنقل المعدني، ومقاومة السكن، والأنسجة وتطوير الأعضاء، وترسب الطاقة، والحماية من الضغوط الحيوية والأحيائية4،5،6،7. ويتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاثة monolignols مختلفة: الصنوبرية, سينابيل وp-كوماريل الكحول التي تستمد من مسار بروبانويد الفينيل8,9. كمية اللجنين وتكوين مونومر تختلف على أساس الأنواع النباتية، ونوع الأنسجة / الجهاز، ومراحل مختلفة من تطوير النبات10. يصنف اللجنين على نطاق واسع إلى الخشب اللين والأخشاب الصلبة واللجنين العشبي استنادا إلى المصدر وتكوين أحادي الليجنول. ويتكون الخشب اللين في المقام الأول من الكحول الصنوبرية 95٪ مع 4٪ ف كوماريل و 1٪ سينابيل الكحول. الخشب الصلب والكحول الصنوبرية والسينابيل بنسب متساوية، في حين يتكون اللجنين العشب من نسب مختلفة من الكحول الصنوبرية، سينابيل وب كوماريل11،12. تكوين مونومرات أمر بالغ الأهمية لأنه يحدد قوة اللجنين، والتحلل، وتدهور جدار الخلية، فضلا عن تحديد التركيب الجزيئي، وتفريع، والربط مع السكريات الأخرى13،14.
اكتسبت أبحاث اللجنين أهمية في الأعلاف وصناعات النسيج والصناعات الورقية والإيثانول الحيوي والوقود الحيوي والمنتجات الحيوية بسبب انخفاض تكلفتها ووفرتها العالية15و16. تم استخدام طرق كيميائية مختلفة (مثل بروميد أسيتيل والمنظفات الحمضية وكلاسون وأكسدة البيرمانجانات) جنبا إلى جنب مع طرق مفيدة (على سبيل المثال ، بالقرب من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (NIR) ، والمنظار بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، والقياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية (UV) ) لتحديد كمية اللجنين9،17. تصنف طرق تحليل اللجنين بشكل عام على أساس الإشعاع الكهرومغناطيسي وقياس الجاذبية والذوبان. واستند المبدأ وراء تقدير اللجنين عن طريق الإشعاع الكهرومغناطيسي على الخصائص الكيميائية لللجنين التي تمتص الضوء في أطوال موجية محددة. وقدرت هذه النتائج على أساس مبدأ أن اللجنين لديه امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أقوى من الكربوهيدرات. في عام 1962، استخدم بولكر وميبرفيلي حبيبات كلوريد البوتاسيوم لتقدير محتوى اللجنين في الخشب18. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها عيوب في تقدير محتوى اللجنين من العينات العشبية بسبب وجود مركبات فينولية غير اللجنين وعدم وجود معامل انقراض مناسب. في عام 1970، وجد فيرجس وغورينغ أن كمية امتصاص مركب غواياسيل وسيرينغيل كانت عند 280 نانومتر و 270 نانومتر، مما صحح مسألة معامل الانقراض لطريقة بولكر ون سومرفل19. وفي وقت لاحق، استخدم التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، وهو تقنية حساسة للغاية لوصف الفينول، لتقدير اللجنين مع كمية صغيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. ومن الأمثلة على هذه التكنولوجيا قياس الطيف تحويل فورييه المنتشر. هذه الطريقة، ومع ذلك، يفتقر إلى معيار مناسب مماثل لطريقة الأشعة فوق البنفسجية20. في وقت لاحق، تم تقدير محتوى اللجنين من قبل NIRS (بالقرب من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء) وNMR (التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي). على الرغم من أن هناك عيوب في هذه الأساليب ، فإنها لا تغير التركيب الكيميائي لللجنين ، مع الحفاظ على نقاوته20.
طريقة كلاسون gravimetric هو الأسلوب التحليلي المباشر والأكثر موثوقية لتقدير اللجنين من ينبع الخشبية. أساس تقدير اللجنين gravimetric هو التحلل المائي / solubilization من المركبات غير اللجنين وجمع اللجنين غير القابلة للذوبان لقياس الجاذبية21. في هذه الطريقة ، تتم إزالة الكربوهيدرات عن طريق التحلل المائي للكتلة الحيوية مع تركيز H2SO4 لاستخراج بقايا اللجنين20،22. يعرف محتوى اللجنين المقدر بهذه الطريقة باسم اللجنين غير القابل للذوبان الحمضي أو كلاسون ليجنين. يعتمد تطبيق طريقة Klason على أنواع النباتات ونوع الأنسجة ونوع جدار الخلية. وجود كميات متغيرة من المكونات غير اللجنين مثل العفص والسكريات والبروتينات، ويؤدي إلى اختلافات متناسبة في تقدير محتويات اللجنين حمض غير قابل للذوبان / قابلة للذوبان. وبالتالي ، ينصح فقط طريقة كلاسون لتقدير اللجنين من الكتلة الحيوية عالية المحتوى اللجنين مثل ينبعالخشبية 17،23. أساليب الذوبان مثل بروميد أسيتيل (AcBr) ، اللجنين غير القابل للذوبان الحمضي ، وحمض ثيوجليكوليك (TGA) هي أكثر الطرق استخداما لتقدير محتوى اللجنين من مصادر الكتلة الحيوية النباتية المختلفة. أنشأ كيم وآخرون طريقتين لاستخراج اللجنين عن طريق التشحيم. الطريقة الأولى تستخرج اللجنين كبقايا غير قابلة للذوبان عن طريق السيلولوز اللحم والهيميسيلولوز ، في حين أن الطريقة الثانية تفصل اللجنين في الكسر القابل للذوبان ، تاركة السليلوز والهيميسيلولوز كبقايا غير قابلة للحل24.
أساليب مماثلة تستخدم في تقدير اللجنين على أساس قابلية الذوبان هي حمض ثيوغليكوليك (TGA) وبروميد أسيتيل (AcBr) أساليب25. كل من أساليب TGA وبروميد أسيتيل تقدير محتوى اللجنين عن طريق قياس امتصاص اللجنين solubilized في 280 نانومتر; ومع ذلك، فإن طريقة AcBr تحط من xylans أثناء عملية اللجنين solubilization ويظهر زيادة كاذبة في محتوى اللجنين26. طريقة ثيوجليكولات (TGA) هي الطريقة الأكثر موثوقية ، لأنها تعتمد على ارتباط محدد مع مجموعات ثيوثير من مجموعات الكحول البنزيل من اللجنين مع TGA. يتم تسريع اللجنين المقيد TGA في ظل ظروف حمضية باستخدام HCl ، ويقدر محتوى اللجنين باستخدام امتصاصه عند 280 نانومتر27. أسلوب TGA له مزايا إضافية من تعديلات هيكلية أقل، وشكل قابل للذوبان من تقدير اللجنين، وأقل تدخلا من المكونات غير اللجنين، وتقدير دقيق لللجنين بسبب الترابط محددة مع TGA.
يتم تعديل طريقة TGA هذه استنادا إلى نوع عينة الكتلة الحيوية النباتية المستخدمة لتقدير محتوى اللجنين. هنا، قمنا بتعديل وتكييف طريقة TGA السريعة من قش الأرز27 إلى أنسجة القطن لتقدير محتوى اللجنين. لفترة وجيزة، تعرضت عينات النباتات المجففة مسحوق لبروتين solubilization العازلة واستخراج الميثانول لإزالة البروتينات وكسر الكحول القابلة للذوبان. وعولجت بقايا الكحول غير القابلة للذوبان مع TGA وعجل اللجنين في ظل ظروف حمضية. تم إنشاء منحنى معيار اللجنين باستخدام اللجنين الخيزران التجارية وتم الحصول على خط الانحدار (y = mx +c). تستخدم قيمة “x” متوسط قيم امتصاص اللجنين عند 280 نانومتر، في حين تم إدخال قيم “m” و “c” من خط الانحدار لحساب تركيز اللجنين غير المعروف في عينات الكتلة الحيوية النباتية القطنية. وتنقسم هذه الطريقة إلى خمس مراحل: 1) إعداد عينات النباتات؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (2) إعداد عينات نباتية؛ (3) إعداد عينات نباتية 2) غسل العينات بالماء والميثانول؛ 3) علاج بيليه مع TGA وحمض لتسريع اللجنين؛ 4) هطول الأمطار من اللجنين؛ و 5) إعداد منحنى القياسية وتقدير محتوى اللجنين للعينة. وتركز المرحلتان الأوليان في المقام الأول على إعداد المواد النباتية تليها المياه، PSB (البروتين solubilization العازلة) واستخراج الميثانول للحصول على المواد غير القابلة للذوبان الكحول. ثم، تم التعامل مع TGA (حمض ثيوغليكوليك) وHCl لتشكيل مجمع مع اللجنين في المرحلة الثالثة. في النهاية، تم استخدام HCl لتسريع اللجنين، الذي تم حله في هيدروكسيد الصوديوم لقياس امتصاصه في 280 نانومتر28.
Protocol
Representative Results
Discussion
يلعب اللجنين دورا هاما في نمو النباتات وتطويرها وقد تمت دراسته مؤخرا على نطاق واسع لتطبيقات الوقود الحيوي والطاقة الحيوية و المنتجات الحيوية. اللجنين غني بالمركبات العطرية التي يتم تخزينها في جميع جدران الخلايا الثانوية النباتية الوعائية. لديها العديد من التطبيقات الصناعية مثل منتجات ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر قسم علوم النبات والتربة والقطن على دعمهم الجزئي لهذه الدراسة.
Materials
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
- Freudenberg, K., Neish, A. C. . Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).
- Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
- Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
- Xu, F., Sun, R. C. . Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).
- Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
- Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
- Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
- Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. . Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).
- Brunow, G. . Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
- Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
- Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
- Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
- Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
- Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
- Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
- Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
- Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
- Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
- Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
- Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
- Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
- Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
- Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
- Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
- Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
- Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
- Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).
