Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Summary

Her præsenterer vi en modificeret TGA-metode til vurdering af ligninindholdet i urteagtig plantebiomasse. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne specifikke tredistre obligationer med lignin og giver en fordel i forhold til Klason-metoden, da den kræver en relativt lille stikprøve til skøn over ligninindholdet.

Abstract

Lignin er en naturlig polymer, der er den næstmest rigelige polymer på Jorden efter cellulose. Lignin er hovedsageligt deponeret i plante sekundære cellevægge og er en aromatisk heteropolymer primært består af tre monolignoler med betydelig industriel betydning. Lignin spiller en vigtig rolle i plantevækst og -udvikling, beskytter mod biotiske og abiotiske belastninger og i kvaliteten af dyrefoder, træ og industrielle ligninprodukter. Et nøjagtigt skøn over ligninindholdet er afgørende for både den grundlæggende forståelse af ligninbiosyntesen og industriel anvendelse af biomasse. Thioglycolic acid (TGA)-metoden er en yderst pålidelig metode til vurdering af det samlede ligninindhold i plantebiomassen. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne dide med benzylalkoholgrupperne af lignin, som er opløselige under alkaliske forhold og uopløselige under sure forhold. Det samlede ligninindhold anslås ved hjælp af en standardkurve genereret fra kommerciel bambus lignin.

Introduction

Lignin er en af de vitale bærende komponenter i plantecellevægge og den næstmest rigelige polymer på Jorden¹. Kemisk er lignin en krydskædet heteropolymer bestående af høj molekylvægt komplekse phenolforbindelser, der danner en naturlig vedvarende kilde til aromatiske polymerer og syntese af biomaterialer^2,3. Denne naturlige polymer spiller en betydelig rolle i plantevækst, udvikling, overlevelse, mekanisk støtte, cellevæg stivhed, vandtransport, mineraltransport, logiresistens, vævs- og organudvikling, aflejring af energi og beskyttelse mod biotiske og abiotiske belastninger^4,5,6,7. Lignin består primært af tre forskellige monolignoler: coniferyl, sinapyl og p-coumaryl alkoholer, der er afledt af phenyl propanoid vej^8,9. Mængden af lignin og sammensætningen af monomerer varierer baseret på plantearterne, vævs-/organtypen og forskellige stadier af planteudvikling¹⁰. Lignin er bredt klassificeret i nåletræ, hårdttræ og græs lignin baseret på kilden og monolignol sammensætning. Nåletræ består primært af 95% nåletræsalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hårdttræ har nåletræ og sinapylalkoholer i lige store mængder, mens græs lignin består af forskellige proportioner af nåletræ, sinapyl og p-coumaryl alkoholer^11,12. Sammensætningen af monomerer er kritisk, da den bestemmer ligninstyrken, nedbrydningen og nedbrydningen af cellevæggen samt bestemmelse af molekylær struktur, forgrening og krydsning med andre polysaccharider^13,14.

Lignin forskning får stadig større betydning i fouragering, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioethanol, biobrændstof, og bio-produkter på grund af sine lave omkostninger og høj overflod^15,16. Forskellige kemiske metoder (f.eks acetylbromid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoxidation) sammen med instrumentale metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultraviolet (UV) spektrofotometri) blev anvendt til ligninkvantificering^9,17. Brunkulsanalysemetoderne klassificeres generelt på grundlag af elektromagnetisk stråling, gravimetry og opløselighed. Princippet bag lignin skøn ved elektromagnetisk stråling var baseret på den kemiske egenskab af lignin, hvormed det absorberer lys ved specifikke bølgelængder. Disse resultater blev anslået ud fra princippet om, at lignin har en stærkere UV-absorbans end kulhydrater. I 1962 brugte Bolker og Somerville kaliumchloridpiller til at anslå ligninindholdet i træ¹⁸. Denne metode har imidlertid ulemper ved estimering af ligninindholdet fra urteagtige prøver på grund af tilstedeværelsen af ikke-lignin phenolforbindelser og fraværet af en passende udryddelseskoefficient. I 1970 fandt Fergus og Goring, at guaiacyl og syringyl sammensatte absorption maxima var på 280 nm og 270 nm, hvilket korrigerede udryddelseskoefficienten udstedelse af Bolker og Somerville metode¹⁹. Senere blev infrarød spektroskopi, en meget følsom teknik til karakterisering af phenolics, også brugt til lignin estimering med en lille mængde plantebiomasseprøver. Et eksempel på en sådan teknologi var diffus-reflektion Fourier transform spektrofotometri. Denne metode mangler imidlertid en ordentlig standard svarende til UV-metoden²⁰. Senere blev ligninindholdet anslået af NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (nuklear magnetisk resonansspektroskopi). Selvom der er ulemper ved disse metoder, ændrer de ikke lignins kemiske struktur og bevarer sin renhed²⁰.

Den gravimetriske Klason-metode er en direkte og den mest pålidelige analysemetode til ligninvurdering af træagtige stængler. Grundlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/opløselighed af ikke-ligninforbindelser og indsamling af uopløselig lignin til gravimetry²¹. I denne metode fjernes kulhydraterne ved hydrolyse af biomassen med koncentreret H₂SO₄ for at udtrække ligninrester^20,22. Ligninindholdet, der anslås ved denne metode, kaldes syreopløselig lignin eller Klason lignin. Anvendelsen af Klason-metoden afhænger af plantearten, vævstypen og cellevægtypen. Tilstedeværelsen af variable mængder ikke-ligninkomponenter såsom tanniner, polysaccharider og proteiner resulterer i proportionale forskelle i skønnet over indholdet af syre uopløseligt/opløseligt ligninindhold. Derfor anbefales Klason-metoden kun til lignin-estimering af biomasse med højt ligninindhold , såsom træagtige stængler^17,23. Opløselighedsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreopløselig lignin og thioglykolsyre (TGA) er mest anvendte metoder til vurdering af ligninindholdet fra forskellige kilder til plantebiomasse. Kim et al. etablerede to metoder til ligninudvinding ved opløselighed. Den første metode ekstraherer lignin som en uopløselig rest ved at opløse cellulose og hemicellulose, mens den anden metode adskiller lignin i den opløselige fraktion, hvilket efterlader cellulose og hemicellulose som det uopløselige reststof²⁴.

Lignende metoder, der anvendes i ligninestimering baseret på opløseligheden, er thioglykolsyre (TGA) og acetylsbromidmetoder (AcBr)²⁵. Både TGA- og acetylphidmetoderne anslår ligninindholdet ved at måle absorbansen af den opløselige lignin ved 280 nm; AcBr-metoden nedbryder imidlertid xylans under processen med lignin-opløselighed og viser en falsk stigning i ligninindholdet²⁶. Thioglycolatmetoden (TGA) er den mere pålidelige metode, da den afhænger af specifik binding med de tregående grupper af benzylalkoholgrupper af lignin med TGA. Den TGA-bundne lignin udfældes under sure forhold ved hjælp af HCl, og ligninindholdet anslås ved hjælp af dets absorbans ved 280 nm²⁷. TGA-metoden har yderligere fordele ved mindre strukturelle ændringer, en opløselig form for ligninvurdering, mindre interferens fra ikke-ligninkomponenter og præcis vurdering af lignin på grund af specifik binding med TGA.

Denne TGA-metode ændres på grundlag af den type plantebiomasseprøve, der anvendes til skøn over ligninindholdet. Her ændrede og tilpassede vi den hurtige TGA-metode med risstrå²⁷ til bomuldsvæv for at estimere ligninindholdet. Kort sagt blev de tørrede pulveriserede planteprøver udsat for proteinopløselighedsbuffer og methanolekstraktion for at fjerne proteiner og alkoholopløselig fraktion. Alkoholuopløselige rester blev behandlet med TGA og udfældet lignin under sure forhold. En lignin standardkurve blev genereret ved hjælp af kommerciel bambus lignin og en regressionslinje (y = mx +c) blev opnået. Værdien “x” anvender gennemsnitlige absorbansværdier for lignin ved 280 nm, mens der er indtastet “m” og “c”-værdier fra regressionslinjen for at beregne ukendt ligninkoncentration i prøver af biomasse af bomuldsanlæg. Denne metode er opdelt i fem faser: 1) fremstilling af planteprøver; 2) vask af prøverne med vand og methanol 3) behandling af pellet med TGA og syre til at udfælde lignin; 4) udfældning af lignin; og 5) standardkurveforberedelse og estimering af ligninindholdet af prøven. De to første faser er primært fokuseret på plantematerialepræparatet efterfulgt af vand, PSB (proteinopløselighedsbuffer) og methanolekstraktioner for at opnå alkoholuopløseligt materiale. Derefter blev det behandlet med TGA (thioglycolic syre) og HCl til at danne et kompleks med lignin i tredje fase. I slutningen blev HCl brugt til at udfælde lignin, som blev opløst i natriumhydroxid for at måle dets absorbans ved 280 nm²⁸.

Protocol

1. Udarbejdelse af planteprøver Indsamle to måneder gamle bomuldsplanter fra drivhuset (Figur 1A). Vend urtepotter forsigtigt for at adskille jord og rødder med intakte laterale rødder ved at løsne jorden omkring planten (Figur 1B). Vask de opsamlede planter grundigt i bakker fyldt med vand for at fjerne alt snavs (til rodprøver)(Figur 1C). Brug papirhåndklæder til at tørre adskilte r…

Representative Results

To forskellige bomuldsforsøgslinjer blev sammenlignet for forskelle i deres ligninindhold i forskellige væv. Indholdet af den udvundne lignin i hver prøve blev målt ved 280 nm og registreret dens respektive absorbansværdier. De gennemsnitlige absorbansværdier for hver biologisk replikat blev sammenlignet med regressionslinjen i ligninstandardkurven (tabel 2, figur 3C). Regressionslinjen, y = mx + c, anvendes til at beregne det ukendte ligninindhold i de udvundne forsø…

Discussion

Lignin spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling og er for nylig blevet grundigt undersøgt for anvendelse af biobrændstof, bioenergi og bioprodukter. Lignin er rig på aromatiske forbindelser, der opbevares i alle vaskulære plante sekundære cellevægge. Det har flere industrielle anvendelser såsom træpanel produkter, bio dispergeringsmidler, flocculants, polyurethan skum og i harpikser af kredsløb^29,30,31. …

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples