Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)
Summary
Hier presenteren we een aangepaste TGA-methode voor het schatten van het ligninegehalte in kruidachtige plantaardige biomassa. Deze methode schat het ligninegehalte door specifieke thioetherbindingen met lignine te vormen en biedt een voordeel ten opzichte van de Klason-methode, omdat het een relatief klein monster vereist voor de schatting van het ligninegehalte.
Abstract
Lignine is een natuurlijk polymeer dat na cellulose het op één na meest voorkomende polymeer op aarde is. Lignine wordt voornamelijk afgezet in secundaire celwanden van planten en is een aromatisch heteropolymeer dat voornamelijk bestaat uit drie monolignolen met een aanzienlijk industrieel belang. Lignine speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten, beschermt tegen biotische en abiotische spanningen en in de kwaliteit van veevoer, het hout en industriële lignineproducten. Een nauwkeurige schatting van het ligninegehalte is essentieel voor zowel fundamenteel begrip van de ligninebiosynthese als industriële toepassingen van biomassa. De thioglycolzuurmethode (TGA) is een zeer betrouwbare methode om het totale ligninegehalte in de plantaardige biomassa te schatten. Deze methode schat het ligninegehalte door thioethers te vormen met de benzylalcoholgroepen lignine, die oplosbaar zijn in alkalische omstandigheden en onoplosbaar in zure omstandigheden. Het totale ligninegehalte wordt geschat met behulp van een standaardcurve die wordt gegenereerd uit commerciële bamboelignine.
Introduction
Lignine is een van de vitale dragende componenten van plantencelwanden en het op een na meest voorkomende polymeer op aarde1. Chemisch is lignine een gekruist heteropolymeer dat bestaat uit complexe fenolverbindingen met een hoog molecuulgewicht die een natuurlijke hernieuwbare bron vormen van aromatische polymeren en synthese van biomaterialen2,3. Dit natuurlijke polymeer speelt een belangrijke rol in plantengroei, ontwikkeling, overleving, mechanische ondersteuning, stijfheid van de celwand, watertransport, mineraaltransport, verblijfsweerstand, weefsel- en orgaanontwikkeling, afzetting van energie en bescherming tegen biotische en abiotischespanningen 4,5,6,7. Lignine bestaat voornamelijk uit drie verschillende monolignolen: coniferyl, sinapyl en p-coumarylalcoholen die zijn afgeleid van de fenyl propanoïde route8,9. De hoeveelheid lignine en de samenstelling van monomeren variëren afhankelijk van de plantensoort, het weefsel/orgaantype en verschillende stadia van plantenontwikkeling10. Lignine is grofweg ingedeeld in zachthout, hardhout en graslignine op basis van de samenstelling van de bron en monolignol. Zachthout bestaat voornamelijk uit 95% coniferylalcohol met 4% p-coumaryl en 1% sinapylalcoholen. Hardhout heeft coniferyl- en sinapylalcoholen in gelijke verhoudingen, terwijl graslignine bestaat uit verschillende verhoudingen coniferyl-, sinapyl- en p-coumarylalcoholen11,12. De samenstelling van monomeren is van cruciaal belang omdat het de ligninesterkte, afbraak en afbraak van de celwand bepaalt, evenals het bepalen van de moleculaire structuur, vertakking en kruiskoppeling met andere polysachariden13,14.
Lignine onderzoek wint aan belang in foerageren, textielindustrieën, papierindustrieën, en voor bio-ethanol, biobrandstof, en bio-producten als gevolg van de lage kosten en hoge overvloed15,16. Verschillende chemische methoden (bijv. acetylbromide, zure detergenten, Klason en permanganaatoxidatie) samen met instrumentele methoden (bijv. near infrared (NIR) spectroscopie, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie en ultraviolette (UV) spectrofotometrie) werden gebruikt voor ligninekwantificering9,17. De analysemethoden van lignine worden over het algemeen geclassificeerd op basis van elektromagnetische straling, gravimetrie en oplosbaarheid. Het principe achter lignine schatting door elektromagnetische straling was gebaseerd op de chemische eigenschap van lignine waarmee het licht absorbeert op specifieke golflengten. Deze resultaten werden geschat op basis van het principe dat lignine een sterkere UV-absorptie heeft dan koolhydraten. In 1962 gebruikten Bolker en Somerville kaliumchloridekorrels om het ligninegehalte in hout te schatten18. Deze methode heeft echter nadelen bij de schatting van het ligninegehalte uit kruidachtige monsters als gevolg van de aanwezigheid van fenolverbindingen zonder lignine en het ontbreken van een geschikte extinctiecoëfficiënt. In 1970 ontdekten Fergus en Goring dat de absorptiemaxima van guaiacyl en syringylverbinding 280 nm en 270 nm bedroegen, wat de uitstervingscoëfficiënt van de Bolker- en Somerville-methode19corrigeerde. Later werd infraroodspectroscopie, een zeer gevoelige techniek voor het karakteriseren van fenolen, ook gebruikt voor lignineschatting met een kleine hoeveelheid biomassamonsters van planten. Een voorbeeld van dergelijke technologie was diffuse reflectie Fourier transform spectrofotometrie. Deze methode mist echter een goede standaard die vergelijkbaar is met de UV-methode20. Later werd het ligninegehalte geschat door NIRS (near infrared spectroscopy) en NMR (nuclear magnetic resonance spectroscopy). Hoewel er nadelen zijn aan deze methoden, veranderen ze de chemische structuur van lignine niet, met behoud van de zuiverheid20.
De gravimetrische Klason-methode is een directe en de meest betrouwbare analysemethode voor lignineschatting van houtachtige stengels. De basis voor gravimetrische lignineschatting is de hydrolyse/solubilisatie van niet-lignineverbindingen en de verzameling van onoplosbare lignine voor gravimetrie21. Bij deze methode worden de koolhydraten verwijderd door hydrolyse van de biomassa met geconcentreerd H2SO4 om lignineresidu20,22te extraheren . Het ligninegehalte dat met deze methode wordt geschat, staat bekend als zure onoplosbare lignine of Klason lignine. De toepassing van de Klason-methode hangt af van de plantensoort, het weefseltype en het celwandtype. De aanwezigheid van variabele hoeveelheden niet-ligninecomponenten zoals tannines, polysachariden en eiwitten resulteert in proportionele verschillen in de schatting van het gehalte aan zure onoplosbare/oplosbare lignine. Daarom wordt de Klason-methode alleen aanbevolen voor lignineschatting van biomassa met een hoog ligninegehalte, zoals houtachtige stengels17,23. Oplosbaarheidsmethoden zoals acetylbromide (AcBr), zuuroplosbare lignine en thioglycolzuur (TGA) zijn de meest gebruikte methoden voor het schatten van het ligninegehalte uit verschillende plantaardige biomassabronnen. Kim et al. stelden twee methoden vast voor lignine-extractie door solubilisatie. De eerste methode extraheert lignine als onoplosbaar residu door cellulose en hemicellulose te oplosbaar te maken, terwijl de tweede methode lignine in de oplosbare fractie scheidt, waardoor cellulose en hemicellulose als onoplosbaar residuachterblijven 24.
Vergelijkbare methoden die worden gebruikt bij de schatting van lignine op basis van de oplosbaarheid zijn thioglycolzuur (TGA) en acetylbromide (AcBr) methoden25. Zowel TGA- als acetylbromidemethoden schatten het ligninegehalte door de absorptie van de solubiliseerde lignine te meten op 280 nm; de AcBr-methode degradeert echter xylanen tijdens het proces van lignine-solubilisatie en vertoont een valse toename van het ligninegehalte26. De thioglycolaatmethode (TGA) is de betrouwbaardere methode, omdat deze afhankelijk is van specifieke binding met de thioethergroepen van benzylalcoholgroepen lignine met TGA. De TGA-gebonden lignine wordt onder zure omstandigheden neergeslagen met behulp van HCl en het ligninegehalte wordt geschat met behulp van zijn absorptie op 280 nm27. De TGA-methode heeft extra voordelen van minder structurele modificaties, een oplosbare vorm van lignineschatting, minder interferentie van niet-ligninecomponenten en nauwkeurige schatting van lignine als gevolg van specifieke binding met TGA.
Deze TGA-methode wordt gewijzigd op basis van het soort biomassamonster van de installatie dat wordt gebruikt voor de schatting van het ligninegehalte. Hier hebben we de snelle TGA-methode van rijststro’s27 aangepast aan katoenweefsels om het ligninegehalte te schatten. Kortom, de gedroogde gepoederde plantenmonsters werden onderworpen aan eiwitoplosbaarheidsbuffer en methanolextractie om eiwitten en de op alcohol oplosbare fractie te verwijderen. Het alcoholonoplosbare residu werd behandeld met TGA en geprecipiteerde lignine onder zure omstandigheden. Een lignine standaard curve werd gegenereerd met behulp van commerciële bamboe lignine en een regressie lijn (y = mx+c) werd verkregen. De “x”-waarde gebruikt gemiddelde absorptiewaarden van lignine bij 280 nm, terwijl “m” en “c”-waarden werden ingevoerd uit de regressielijn om de onbekende lignineconcentratie in biomassamonsters van katoenfabrieken te berekenen. Deze methode is verdeeld in vijf fasen: 1) bereiding van plantenmonsters; 2) het wassen van de monsters met water en methanol; 3) behandeling van de pellet met TGA en zuur om lignine neer te doen; 4) neerslag van lignine; en 5) de standaardcurvevoorbereiding en de schatting van het ligninegehalte van het monster. De eerste twee fasen zijn voornamelijk gericht op de bereiding van plantaardig materiaal, gevolgd door water, PSB (eiwitoplosbaarheidsbuffer) en methanolextracties om het onoplosbare alcoholmateriaal te verkrijgen. Vervolgens werd het behandeld met TGA (thioglycolzuur) en HCl om in de derde fase een complex met lignine te vormen. Aan het einde werd HCl gebruikt om lignine neer te doen, dat werd opgelost in natriumhydroxide om de absorptie ervan te meten bij 280 nm28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lignine speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten en is onlangs uitgebreid bestudeerd voor biobrandstof, bio-energie en bioproducttoepassingen. Lignine is rijk aan aromatische verbindingen die worden opgeslagen in alle secundaire celwanden van vasculaire planten. Het heeft verscheidene industriële toepassingen zoals houten paneelproducten, biodispersies, flocculanten, polyurethaanschuimen en in harsen van kringsraad29,30,<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het Department of Plant &Soil Science en Cotton Inc. voor hun gedeeltelijke steun aan deze studie.
Materials
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
- Freudenberg, K., Neish, A. C. . Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).
- Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
- Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
- Xu, F., Sun, R. C. . Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).
- Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
- Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
- Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
- Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. . Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).
- Brunow, G. . Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
- Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
- Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
- Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
- Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
- Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
- Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
- Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
- Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
- Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
- Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
- Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
- Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
- Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
- Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
- Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
- Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
- Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
- Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).
