Estimation de la teneur en lignine de la biomasse végétale à l’aide de l’acide thioglycolique (TGA)

Summary

Ici, nous présentons une méthode TGA modifiée pour l’estimation de la teneur en lignine dans la biomasse végétale herbacée. Cette méthode estime la teneur en lignine en formant des liaisons thioéther spécifiques avec la lignine et présente un avantage par rapport à la méthode Klason, car elle nécessite un échantillon relativement petit pour l’estimation de la teneur en lignine.

Abstract

La lignine est un polymère naturel qui est le deuxième polymère le plus abondant sur Terre après la cellulose. La lignine est principalement déposée dans les parois cellulaires secondaires des plantes et est un hétéropolymère aromatique principalement composé de trois monolignols d’importance industrielle significative. La lignine joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes, protège des stress biotiques et abiotiques et de la qualité des aliments pour animaux, du bois et des produits industriels à base de lignine. Une estimation précise de la teneur en lignine est essentielle à la fois pour une compréhension fondamentale de la biosynthèse de la lignine et pour les applications industrielles de la biomasse. La méthode de l’acide thioglycolique (TGA) est une méthode très fiable d’estimation de la teneur totale en lignine dans la biomasse végétale. Cette méthode estime la teneur en lignine en formant des thioéthers avec les groupes alcool benzylique de la lignine, qui sont solubles dans des conditions alcalines et insolubles dans des conditions acides. La teneur totale en lignine est estimée à l’aide d’une courbe standard générée à partir de la lignine de bambou commerciale.

Introduction

La lignine est l’un des composants porteurs vitaux des parois cellulaires végétales et le deuxième polymère le plus abondant sur Terre^1. Chimiquement, la lignine est un hétéropolymère réticulé constitué de composés phénoliques complexes de haut poids moléculaire qui forment une source naturelle renouvelable de polymères aromatiques et de synthèse de biomatériaux^2,3. Ce polymère naturel joue un rôle important dans la croissance, le développement, la survie, le support mécanique, la rigidité de la paroi cellulaire, le transport de l’eau, le transport des minéraux, la résistance à la verse, le développement des tissus et des organes, le dépôt d’énergie et la protection contre les stress biotiques et abiotiques^4,5,6,7. La lignine est principalement composée de trois monolignols différents : les alcools coniféryle, sinapyle et p-coumaryle qui sont dérivés de la voie phényl propanoïde^8,9. La quantité de lignine et la composition des monomères varient en fonction de l’espèce végétale, du type de tissu/organe et des différents stades de développement de la plante¹⁰. La lignine est généralement classée en résineux, bois dur et lignine de gramin en fonction de la source et de la composition du monolignol. Le résineux est principalement composé de 95 % d’alcool de conifère avec 4 % d’alcools de p-coumaryl et 1 % d’alcools sinapyliques. Le bois dur contient des alcools conifères et sinapyliques dans des proportions égales, tandis que la lignine herbinée est composée de diverses proportions d’alcools conifères, sinapyle et p-coumaryle^11,12. La composition des monomères est critique car elle détermine la force de la lignine, la décomposition et la dégradation de la paroi cellulaire ainsi que la détermination de la structure moléculaire, de la ramification et de la réticulation avec d’autres polysaccharides^13,14.

La recherche sur la lignine gagne en importance dans les industries de la recherche de nourriture, du textile, du papier et du bioéthanol, des biocarburants et des bioproduits en raison de son faible coût et de son abondance élevée^15,16. Diverses méthodes chimiques (p. ex. bromure d’acétyle, détergents acides, Klason et oxydation du permanganate) ainsi que des méthodes instrumentales (p. ex. spectroscopie proche infrarouge (NIR), spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et spectrophotométrie ultraviolette (UV)) ont été utilisées pour la quantification de la lignine^9,17. Les méthodes d’analyse de la lignine sont généralement classées en fonction du rayonnement électromagnétique, de la gravimétrie et de la solubilité. Le principe de l’estimation de la lignine par rayonnement électromagnétique était basé sur la propriété chimique de la lignine par laquelle elle absorbe la lumière à des longueurs d’onde spécifiques. Ces résultats ont été estimés sur la base du principe que la lignine a une absorbance UV plus forte que les glucides. En 1962, Bolker et Somerville ont utilisé des granulés de chlorure de potassium pour estimer la teneur en lignine du bois¹⁸. Cependant, cette méthode présente des inconvénients dans l’estimation de la teneur en lignine à partir d’échantillons herbacés en raison de la présence de composés phénoliques autres que la lignine et de l’absence d’un coefficient d’extinction approprié. En 1970, Fergus et Goring ont constaté que les maxima d’absorption des composés guaiacyle et syringyle étaient à 280 nm et 270 nm, ce qui corrigeait la question du coefficient d’extinction de la méthode de Bolker et Somerville^19. Plus tard, la spectroscopie infrarouge, une technique très sensible pour caractériser les composés phénoliques, a également été utilisée pour l’estimation de la lignine avec une petite quantité d’échantillons de biomasse végétale. Un exemple d’une telle technologie était la spectrophotométrie à transformée de Fourier à réflectance diffuse. Cette méthode, cependant, manque d’une norme appropriée similaire à la méthode UV²⁰. Plus tard, la teneur en lignine a été estimée par NIRS (spectroscopie proche infrarouge) et RMN (spectroscopie par résonance magnétique nucléaire). Bien qu’il y ait des inconvénients dans ces méthodes, elles ne modifient pas la structure chimique de la lignine, conservant sa pureté²⁰.

La méthode gravimétrique Klason est une méthode analytique directe et la plus fiable pour l’estimation de la lignine des tiges ligneuses. La base de l’estimation gravimétrique de la lignine est l’hydrolyse/solubilisation de composés non-lignine et la collecte de lignine insoluble pour la gravimétrie^21. Dans ce procédé, les glucides sont éliminés par hydrolyse de la biomasse avec le concentré_H2SO4pour extraire le résidu de lignine^20,22. La teneur en lignine estimée par cette méthode est connue sous le nom de lignine insoluble acide ou de lignine Klason. L’application de la méthode Klason dépend de l’espèce végétale, du type de tissu et du type de paroi cellulaire. La présence de quantités variables de composants non lignins tels que les tanins, les polysaccharides et les protéines entraîne des différences proportionnelles dans l’estimation des teneurs en lignine insolubles/solubles dans l’acide. Par conséquent, la méthode Klason n’est recommandée que pour l’estimation de la lignine de la biomasse à forte teneur en lignine telle que les tiges ligneuses^17,23. Les méthodes de solubilité telles que le bromure d’acétyle (AcBr), la lignine insoluble dans l’acide et l’acide thioglycolique (TGA) sont les méthodes les plus couramment utilisées pour estimer la teneur en lignine de diverses sources de biomasse végétale. Kim et coll. ont établi deux méthodes pour l’extraction de la lignine par solubilisation. La première méthode extrait la lignine comme résidu insoluble en solubilisant la cellulose et l’hémicellulose, tandis que la seconde méthode sépare la lignine dans la fraction soluble, laissant la cellulose et l’hémicellulose comme résidu insoluble^24.

Les méthodes similaires utilisées dans l’estimation de la lignine sur la base de la solubilité sont l’acide thioglycolique (TGA) et le bromure d’acétyle (AcBr)^25. Les méthodes de TGA et de bromure d’acétyle estiment la teneur en lignine en mesurant l’absorbance de la lignine solubilisée à 280 nm; cependant, la méthode AcBr dégrade les xylanes au cours du processus de solubilisation de la lignine et montre une fausse augmentation de la teneur en lignine^26. La méthode du thioglycolate (TGA) est la méthode la plus fiable, car elle dépend d’une liaison spécifique avec les groupes thioéther des groupes alcool benzylique de la lignine avec TGA. La lignine liée au TGA est précipitée dans des conditions acides à l’aide de HCl, et la teneur en lignine est estimée en utilisant son absorbance à 280^nm27. La méthode TGA présente des avantages supplémentaires de moins de modifications structurelles, d’une forme soluble d’estimation de la lignine, de moins d’interférence des composants non-lignine et d’une estimation précise de la lignine en raison d’une liaison spécifique avec la TGA.

Cette méthode TGA est modifiée en fonction du type d’échantillon de biomasse végétale utilisé pour l’estimation de la teneur en lignine. Ici, nous avons modifié et adapté la méthode TGA rapide des pailles de riz²⁷ aux tissus de coton pour estimer la teneur en lignine. En bref, les échantillons de plantes en poudre séchées ont été soumis à un tampon de solubilisation des protéines et à une extraction au méthanol pour éliminer les protéines et la fraction soluble dans l’alcool. Le résidu insoluble dans l’alcool a été traité avec de la TGA et a précipité de la lignine dans des conditions acides. Une courbe standard de lignine a été générée utilisant la lignine commerciale de bambou et une droite de régression (y = mx+c) a été obtenue. La valeur « x » utilise des valeurs moyennes d’absorbance de la lignine à 280 nm, tandis que les valeurs « m » et « c » ont été entrées à partir de la droite de régression pour calculer la concentration inconnue de lignine dans des échantillons de biomasse de plantes cotonnières. Cette méthode est divisée en cinq phases: 1) préparation des échantillons de plantes; 2) laver les échantillons avec de l’eau et du méthanol; 3) traitement de la pastille avec de la TGA et de l’acide pour précipiter la lignine; 4) précipitation de la lignine; et 5) la préparation de la courbe standard et l’estimation de la teneur en lignine de l’échantillon. Les deux premières phases sont principalement axées sur la préparation du matériel végétal suivie de l’eau, du PSB (tampon de solubilisation des protéines) et des extractions de méthanol pour obtenir la matière insoluble dans l’alcool. Ensuite, il a été traité avec de la TGA (acide thioglycolique) et du HCl pour former un complexe avec de la lignine dans la troisième phase. A la fin, HCl a été utilisé pour précipiter la lignine, qui a été dissoute dans de l’hydroxyde de sodium pour mesurer son absorbance à 280 nm^28.

Protocol

1. Préparation des échantillons de plantes Recueillir des plants de coton âgés de deux mois dans la serre (Figure 1A). Retournez doucement les pots de plantes pour séparer le sol et les racines avec des racines latérales intactes en assouplissant le sol autour de la plante(Figure 1B). Lavez soigneusement les plantes collectées dans des plateaux remplis d’eau pour enlever toute la saleté (pour les échantillons de racines) …

Representative Results

Deux lignées expérimentales de coton différentes ont été comparées pour des différences dans leurs teneurs en lignine dans différents tissus. La teneur en lignine extraite de chaque échantillon a été mesurée à 280 nm et a enregistré ses valeurs d’absorbance respectives. Les valeurs moyennes d’absorbance de chaque répétition biologique ont été comparées à la droite de régression de la courbe standard de lalignine (tableau 2, figure 3C). La droite de r…

Discussion

La lignine joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes et a récemment fait l’objet d’études approfondies pour des applications de biocarburants, de bioénergie et de bioproduits. La lignine est riche en composés aromatiques qui sont stockés dans toutes les parois cellulaires secondaires des plantes vasculaires. Il a plusieurs applications industrielles telles que les panneaux de bois, les bio dispersants, les floculants, les mousses de polyuréthane et dans les résines de circuits…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples