थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान
Summary
यहां, हम जड़ी-बूटियों के पौधे बायोमास में लिग्निन सामग्री के अनुमान के लिए एक संशोधित टीजीए विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि लिग्निन के साथ विशिष्ट थिओएथर बांड बनाकर लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाता है और क्लासन विधि पर एक लाभ प्रस्तुत करता है, क्योंकि इसके लिए लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए अपेक्षाकृत छोटे नमूने की आवश्यकता होती है।
Abstract
लिग्निन एक प्राकृतिक बहुलक है जो सेल्यूलोज के बाद पृथ्वी पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। लिग्निन मुख्य रूप से पौधे माध्यमिक सेल की दीवारों में जमा किया जाता है और यह एक सुगंधित हेट्रोपॉलिमर है जो मुख्य रूप से महत्वपूर्ण औद्योगिक महत्व के साथ तीन मोनोलिग्नोल से बना है। लिग्निन पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बायोटिक और अजैविक तनावों से बचाता है, और पशु चारे, लकड़ी और औद्योगिक लिग्निन उत्पादों की गुणवत्ता में। लिग्निन बायोसिंथेसिस और बायोमास के औद्योगिक अनुप्रयोगों की मौलिक समझ दोनों के लिए लिग्निन सामग्री का सटीक अनुमान आवश्यक है। थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) विधि पौधे बायोमास में कुल लिग्निन सामग्री का आकलन करने की एक अत्यधिक विश्वसनीय विधि है। इस विधि लिग्निन के बेंजाइल अल्कोहल समूहों के साथ थिओएथर्स बनाकर लिग्निन सामग्री का अनुमान है, जो क्षारीय स्थितियों में घुलनशील और अम्लीय स्थितियों में अघुलनशील हैं। वाणिज्यिक बांस लिग्निन से उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करके कुल लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाया गया है।
Introduction
लिग्निन संयंत्र कोशिका दीवारों के महत्वपूर्ण लोड-असर घटकों में से एक है और पृथ्वी1पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। रासायनिक रूप से, लिग्निन एक क्रॉसलिंक्ड हेट्रोपॉलिमर है जो उच्च आणविक वजन जटिल फेनोलिक यौगिकों से बना होता है जो सुगंधित बहुलक का प्राकृतिक नवीकरणीय स्रोत और बायोमैटेरियल्स2,3का संश्लेषण करता है। यह प्राकृतिक बहुलक पौधों के विकास, विकास, अस्तित्व, यांत्रिक समर्थन, सेल दीवार कठोरता, जल परिवहन, खनिज परिवहन, आवास प्रतिरोध, ऊतक और अंग विकास, ऊर्जा के जमाव, और जैव और अजैविक तनाव से सुरक्षा4,5,6,7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। लिग्निन मुख्य रूप से तीन अलग-अलग मोनोलिग्नोल से बना है: कोनिफेरिल, सिनापिल और पी-कौमेरिल अल्कोहल जो फिनाइल प्रोपेनोइड पाथवे8,9से प्राप्त होते हैं। लिग्निन की मात्रा और मोनोमर की संरचना पौधों की प्रजातियों, ऊतक/अंग प्रकार, और पौधे के विकास के विभिन्न चरणों के आधार पर भिन्न होती है10। लिग्निन को मोटे तौर पर स्रोत और मोनोलिग्नोल संरचना के आधार पर सॉफ़्टवुड, दृढ़ लकड़ी और घास लिग्निन में वर्गीकृत किया गया है। सॉफ़्टवुड मुख्य रूप से 4% पी-कौमेरिल और 1% सिनापिल अल्कोहल के साथ 95% शंकुधारी अल्कोहल से बना है। हार्डवुड में शंकुधारी और सिनेपिल अल्कोहल समान अनुपात में होते हैं, जबकि घास लिग्निन कोनिफेरिल, सिनेपिल और पी-कौमेरिल अल्कोहल11,12के विभिन्न अनुपातों से बना है। मोनोमर की संरचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सेल दीवार की लिग्निन शक्ति, अपघटन और क्षरण के साथ-साथ आणविक संरचना, शाखाओं में बंटी और अन्य पॉलीसैकराइड्स13, 14के साथ क्रॉसलिंकिंग का निर्धारण करती है।
लिग्निन अनुसंधान अपनी कम लागत और उच्च बहुतायत15, 16के कारण फोर्जिंग, कपड़ा उद्योगों, कागज उद्योगों और बायोथेनॉल, जैव ईंधन और जैव-उत्पादों के लिए महत्व प्राप्त कर रहा है। विभिन्न रासायनिक तरीकों (जैसे, एसीटाइल ब्रोमाइड, एसिड डिटर्जेंट, क्लासन, और परमंगनेट ऑक्सीकरण) के साथ वाद्य तरीकों (उदाहरण के लिए, अवरक्त (एनआईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, और पराबैंगनी (यूवी) स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री) का उपयोग लिग्निन क्वांटिफिकेशनकेलिए किया गयाथा। लिग्निन के विश्लेषण विधियों को आम तौर पर विद्युत चुम्बकीय विकिरण, गुरुत्वाकर्षण और घुलनशीलता के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है। विद्युत चुम्बकीय विकिरण द्वारा लिग्निन अनुमान के पीछे का सिद्धांत लिग्निन की रासायनिक संपत्ति पर आधारित था जिसके द्वारा यह विशिष्ट तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित करता है। इन परिणामों का अनुमान सिद्धांत के आधार पर लगाया गया था कि लिग्निन में कार्बोहाइड्रेट की तुलना में एक मजबूत यूवी अवशोषण है। 1 9 62 में, बोल्कर और सोमरविले ने लकड़ी18में लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाने के लिए पोटेशियम क्लोराइड छर्रों का उपयोग किया। हालांकि, इस विधि में गैर-लिग्निन फेनोलिक यौगिकों की उपस्थिति और उचित विलुप्त होने के गुणांक के अभाव के कारण जड़ी-बूटियों के नमूनों से लिग्निन सामग्री के अनुमान में कमियां हैं। 1 9 70 में, फर्गस और गोरिंग ने पाया कि गुआसिल और सिरिंगिल यौगिक अवशोषण मैक्सिमा 280 एनएम और 270 एनएम पर थे, जिसने बोल्कर और सोमरविले विधि19के विलुप्त होने के गुणांक मुद्दे को सही किया। बाद में, फिनोलिक्स की विशेषता के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग पौधे बायोमास नमूनों की थोड़ी मात्रा के साथ लिग्निन अनुमान के लिए भी किया गया था। इस तरह की तकनीक का एक उदाहरण फैलाना-परावर्तन फोरियर ट्रांसफॉर्म स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री था। हालांकि, इस विधि में यूवी विधि20के समान उचित मानक का अभाव है। बाद में, लिग्निन सामग्री का अनुमान एनआईआरएस (नियर इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी) और एनएमआर (न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेओनेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी) द्वारा लगाया गया था। हालांकि, इन तरीकों में नुकसान हैं, वे लिग्निन की रासायनिक संरचना को नहीं बदलते हैं, इसकी शुद्धता को बनाए रखतेहैं 20।
ग्रेविमेट्रिक क्लासन विधि वुडी उपजी के लिग्निन अनुमान के लिए एक प्रत्यक्ष और सबसे विश्वसनीय विश्लेषणात्मक विधि है। ग्रेविमेट्रिक लिग्निन अनुमान का आधार गैर-लिग्निन यौगिकों का हाइड्रोलिसिस/घुलनशीलता और ग्रेविमेट्री21के लिए अघुलनशील लिग्निन का संग्रह है । इस विधि में, कार्बोहाइड्रेट को बायोमास के हाइड्रोलिसिस द्वारा हटा दिया जाता है जिसमें केंद्रित एच 2 एसओ4 लिग्निन अवशेष20, 22निकालने के लिए कियाजाताहै। इस विधि से अनुमानित लिग्निन सामग्री को एसिड अघुलनशील लिग्निन या क्लासन लिग्निन के रूप में जाना जाता है। क्लासन विधि का अनुप्रयोग पौधों की प्रजातियों, ऊतक प्रकार और सेल दीवार प्रकार पर निर्भर करता है। टैनिन, पॉलीसैकराइड और प्रोटीन जैसे गैर-लिग्निन घटकों की चर मात्रा की उपस्थिति के परिणामस्वरूप एसिड अघुलनशील/घुलनशील लिग्निन सामग्री के अनुमान में आनुपातिक अंतर होता है । इसलिए, क्लासन विधि केवल उच्च-लिग्निन सामग्री बायोमास जैसे वुडी उपजी17,23के लिग्निन अनुमान के लिए अनुशंसित है। एसिटिल ब्रोमाइड (एसीबीआर), एसिड-अघुलनशील लिग्निन और थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) जैसे सोलुबिलिटी विधियां आमतौर पर विभिन्न पौधे बायोमास स्रोतों से लिग्निन सामग्री के अनुमान के लिए उपयोग की जाने वाली विधियां हैं। किम एट अल. घुलनशीलता द्वारा लिग्निन निष्कर्षण के लिए दो तरीकों की स्थापना की । पहली विधि सेल्यूलोज और हेमीसेल्यूलोज को घुलनशील बनाकर एक अघुलनशील अवशेषों के रूप में लिग्निन निकालती है, जबकि दूसरी विधि घुलनशील अंश में लिग्निन को अलग करती है, जिससे सेल्यूलोज और हेमीसेल्यूलोज को अघुलनशील अवशेष24के रूप में छोड़ दिया जाता है।
इसी तरह की विधिएं लिग्निन अनुमान में घुलनशीलता के आधार पर नियोजित थेओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) और एसिटिल ब्रोमाइड (एसीबीआर) विधियां25हैं। टीजीए और एसिटिल ब्रोमाइड दोनों तरीकों से 280 एनएम पर घुलनशील लिग्निन के अवशोषण को मापकर लिग्निन सामग्री का अनुमान है; हालांकि, AcBr विधि लिग्निन घुलनीकरण की प्रक्रिया के दौरान जाइलांस नीचा दिखाती है और लिग्निन सामग्री26में एक झूठी वृद्धि से पता चलता है . थिओग्लिकोलेट (टीजीए) विधि अधिक विश्वसनीय विधि है, क्योंकि यह टीजीए के साथ लिग्निन के बेंजिल अल्कोहल समूहों के थिओएथर समूहों के साथ विशिष्ट संबंध पर निर्भर करता है। टीजीए बाउंड लिग्निन एचसीएल का उपयोग करके अम्लीय परिस्थितियों में उपजी है, और लिग्निन सामग्री 280 एनएम27पर इसके अवशोषण का उपयोग करके अनुमानित है। टीजीए विधि में कम संरचनात्मक संशोधनों के अतिरिक्त लाभ, लिग्निन अनुमान का घुलनशील रूप, गैर-लिग्निन घटकों से कम हस्तक्षेप, और टीजीए के साथ विशिष्ट संबंध के कारण लिग्निन का सटीक अनुमान है।
इस टीजीए विधि को लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधे बायोमास नमूने के आधार पर संशोधित किया गया है। यहां, हमने लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाने के लिए चावल के तिनके27 की तेजी से टीजीए विधि को कपास ऊतकों में संशोधित और अनुकूलित किया। संक्षेप में, सूखे पाउडर पौधे के नमूनों को प्रोटीन घुलनशीलता बफर और मेथनॉल निष्कर्षण के अधीन किया गया था ताकि प्रोटीन और अल्कोहल घुलनशील अंश को हटाया जा सके । शराब अघुलनशील अवशेषों को टीजीए के साथ इलाज किया गया और अम्लीय परिस्थितियों में लिग्निन उपजी । वाणिज्यिक बांस लिग्निन का उपयोग करके एक लिग्निन मानक वक्र उत्पन्न किया गया था और एक प्रतिगमन रेखा (वाई = एमएक्स + सी) प्राप्त की गई थी। “एक्स” मूल्य 280 एनएम पर लिग्निन के औसत अवशोषण मूल्यों का उपयोग करता है, जबकि कपास संयंत्र बायोमास नमूनों में अज्ञात लिग्निन एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रतिगमन रेखा से “एम” और “सी” मूल्यों में प्रवेश किया गया था। इस विधि को पांच चरणों में विभाजित किया गया है: 1) पौधों के नमूनों की तैयारी; 2) पानी और मेथनॉल के साथ नमूनों को धोना; 3) टीजीए और एसिड के साथ गोली का उपचार लिग्निन को कम करने के लिए; 4) लिग्निन की वर्षा; और 5) नमूने के मानक वक्र तैयारी और लिग्निन सामग्री अनुमान। पहले दो चरणों में मुख्य रूप से संयंत्र सामग्री की तैयारी पर ध्यान केंद्रित कर रहे है पानी, पीएसबी (प्रोटीन घुलनशीलता बफर) और मेथनॉल अर्क के बाद शराब अघुलनशील सामग्री प्राप्त करने के लिए । इसके बाद तीसरे चरण में लिग्निन के साथ कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए टीजीए (थिओग्लाइकोलिक एसिड) और एचसीएल के साथ इसका इलाज किया गया । अंत में, एचसीएल का उपयोग लिग्निन को कम करने के लिए किया गया था, जिसे सोडियम हाइड्रोक्साइड में 280 एनएम28पर इसके अवशोषण को मापने के लिए भंग कर दिया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
लिग्निन पौधे के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और हाल ही में जैव ईंधन, जैव ऊर्जा और जैव उत्पादन अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। लिग्निन सुगंधित यौगिकों में समृद्ध…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन के आंशिक समर्थन के लिए संयंत्र और मृदा विज्ञान और कपास इंक विभाग को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
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