티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정
Summary
여기서, 우리는 초본 식물 바이오 매스에서 리그닌 함량의 추정을위한 수정 된 TGA 방법을 제시한다. 이 방법은 리그닌과 특정 티오에테르 결합을 형성하여 리그닌 함량을 추정하고, 리그닌 함량 추정을 위해 상대적으로 작은 샘플을 필요로 하기 때문에 클라슨 방법에 비해 이점을 제시한다.
Abstract
Lignin은 셀룰로오스 다음으로 지구상에서 두 번째로 풍부한 중합체인 천연 중합체입니다. Lignin은 주로 식물 이차 세포벽에 증착되며 주로 산업적 중요성이 있는 3개의 모노리그놀로 구성된 방향족 이성포성입니다. Lignin은 식물 의 성장과 개발에 중요한 역할을하며, 생체 및 생물학적 스트레스로부터 보호하며, 동물 사료, 목재 및 산업용 리그닌 제품의 품질에서 보호합니다. 리그닌 함량의 정확한 추정은 리그닌 생합성과 바이오매스의 산업 응용 에 대한 근본적인 이해 모두에 필수적입니다. 티오글리콜산(TGA) 방법은 식물 바이오매스의 총 리그닌 함량을 추정하는 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 방법은 알칼리성 조건에서 용해되고 산성 조건에서 불용성인 리그닌의 벤질 알코올 군으로 티오에테르를 형성하여 리그닌 함량을 추정한다. 총 리그닌 함량은 상업용 대나무 리그닌에서 생성된 표준 곡선을 사용하여 추정됩니다.
Introduction
Lignin은 식물 세포벽의 중요한 하중 베어링 구성 요소 중 하나이며 지구 1에서 두 번째로 풍부한폴리머입니다. 화학적으로, 리그닌은 아로마 폴리머의 자연 재생 가능한 공급원을 형성하는 고분자량 복합 페놀 화합물로 구성된 교차형 이성포합체이며 생체 재료2,3. 이 천연 폴리머는 식물 성장, 발달, 생존, 기계적 지원, 세포벽 강성, 물 수송, 광물 수송, 숙박 저항, 조직 및 장기 개발, 에너지 증착 및 생체 및 생물학적 스트레스4,5,6,7로부터의보호에 중요한 역할을 한다. Lignin은 주로 세 가지 다른 모노리그놀로 구성됩니다: 코니페릴, 시나필 및 페닐 프로파노이드통로에서파생된 p-coumaryl 알코올8,9. 리닌의 양과 단량의 조성물은 식물 종, 조직/장기 유형 및 식물 개발의 상이한 단계에 따라다릅니다(10). 리그닌은 소스와 모노리그놀 조성에 기초하여 침엽수, 나무, 잔디 리그닌으로 광범위하게 분류됩니다. 소프트우드는 주로 4% p-coumaryl과 1% 시나필 알코올로 95%의 침엽수 알코올로 구성됩니다. 나무는 같은 비율로 수막과 시나필 알코올을 가지고 있으며, 잔디 리그닌은 40eryl, 시나필 및 p-coumaryl 알코올11,12의다양한 비율로 구성됩니다. 단량체의 조성은 세포벽의 리그닌 강도, 분해 및 분해뿐만 아니라 분자 구조, 분기 및 다른다당류(13,14)와교차하는 것을 결정하기 때문에 중요하다.
Lignin 연구는 저비용과 높은풍요로움15,16로인해 섬유 산업, 제지 산업 및 바이오 에탄올, 바이오 연료 및 바이오 제품에 대한 중요성을 얻고 있습니다. 다양한 화학적 방법(예를 들어, 아세틸 브로마이드, 산세제, 클라손, 퍼망가네이트 산화)와 기악방법(예를 들어, 근적외선(NIR) 분광법, 핵자기공명(NMR) 분광법 및 자외선(UV) 분광성제17호에사용하였다. 리그닌의 분석 방법은 일반적으로 전자기 방사선, 중력 및 용해도에 따라 분류됩니다. 전자기 방사선에 의한 리그닌 추정의 원리는 특정 파장에서 빛을 흡수하는 리그닌의 화학적 특성에 기초했다. 이러한 결과는 리그닌이 탄수화물보다 더 강한 UV 흡광도를 가지고 있다는 원리에 따라 추정되었다. 1962년 볼커와 서머빌은 염화칼륨 펠릿을 사용하여18번나무의 리그닌 함량을 추정했다. 그러나, 이 방법은 비리닌 페놀 화합물의 존재와 적절한 소멸 계수의 부재로 인해 초본 샘플로부터 의 리그닌 함량의 추정에 단점이 있다. 1970년 퍼거스와 고링은 구아실과 실리실 화합물 흡수 극대화가 280nm와 270nm에 있는 것으로 나타났으며, 볼커와 서머빌 방법19의멸종 계수 문제를 수정했다. 나중에 페놀을 특성화하기 위한 매우 민감한 기술인 적외선 분광법은 소량의 식물 바이오매스 샘플을 가진 리그닌 추정에도 사용되었습니다. 이러한 기술의 한 가지 예는 분산 반사포리미티에 변형 분광측정법이었습니다. 그러나 이 방법은 UV방법(20)과유사한 적절한 표준이 부족하다. 나중에, 리그닌 함량은 NIRS (근적외선 분광법) 및 NMR (핵 자기 공명 분광법)에 의해 추정되었다. 그러나, 이러한 방법에단점이 있다, 그들은 리그닌의 화학 구조를 변경하지 않습니다, 그 순도유지 20.
그레이비메트릭 클라슨 방법은 우디 줄기의 리그닌 추정을 위한 직접적이고 신뢰할 수 있는 분석 방법입니다. 그레이비메트릭 리그닌 추정의 기초는 비리그닌 화합물의 가수분해/용해화 및 중력에 대한 불용성 리그닌의수집이다(21). 이 방법에서, 탄수화물은 농축 된 H2SO4를 가진 바이오 매스의 가수분해에 의해 제거되어 리그닌 잔류물20,22를추출한다. 이 방법에 의해 추정된 리그닌 함량은 산 불용성 리그닌 또는 클라손 리그닌이라고 합니다. Klason 방법의 적용은 식물 종, 조직 유형 및 세포벽 유형에 따라 다릅니다. 탄닌, 다당류 및 단백질과 같은 비 리그닌 성분의 가변적인 양의 존재는 산 불용성/수용성 리그닌 함량의 추정에 비례적인 차이를 초래합니다. 따라서, 클라슨 방법은 우디줄기(17,23)와같은 고리닌 함량 바이오매스의 리닌 추정에만 권장된다. 아세틸 브로마이드(AcBr), 산불용성 리그닌, 티오글리콜산(TGA)과 같은 용해도 방법은 다양한 식물 바이오매스 소스로부터 리그닌 함량을 추정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 김 외는 용해도에 의한 리그닌 추출을 위한 두 가지 방법을 확립했다. 제1방법은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 용해시킴으로써 용해성 잔류물로서 리그닌을 추출하고, 두 번째 방법은 용해 분획에서 리그닌을 분리하여 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 용해성잔류물(24)로남겨두는다.
용해도에 기초하여 리그닌 추정에 사용되는 유사한 방법은 티글리글리콜산(TGA) 및 아세틸 브로마이드(AcBr)방법(25)이다. TGA와 아세틸 브로마이드 방법 모두 280 nm에서 용액화된 리그닌의 흡광도를 측정하여 리그닌 함량을 추정합니다. 그러나, AcBr 방법은 리그닌 용해화 과정에서 자일란을 저하시키고 리그닌함량(26)의잘못된 증가를 나타낸다. 티오글리콜레이트(TGA) 방법은 TGA를 이용한 리그닌의 벤실 알코올 그룹의 티오에테르 그룹과의 특정 결합에 의존하기 때문에 보다 신뢰할 수 있는 방법입니다. TGA 바운드 리그닌은 HCl을 이용한 산성 조건하에서 침전되며, 리그닌 함량은 280nm27에서흡광도를 이용하여 추정된다. TGA 방법은 덜 구조적 수정, 리그닌 추정의 가용성 형태, 비 리그닌 성분의 간섭 감소, TGA와의 특정 결합으로 인한 리그닌의 정확한 추정의 추가 이점이 있습니다.
이러한 TGA 방법은 리그닌 함량 추정에 사용되는 식물 바이오매스 샘플의 종류에 따라 수정된다. 여기서, 우리는 리닌 함량을 추정하기 위해 면 조직에 쌀 빨대(27)의 급속한 TGA 방법을 수정하고 적응시켰다. 간단히, 건조된 분말 식물 샘플은 단백질 및 알코올 용해 분획을 제거하기 위해 단백질 용해화 완충제 및 메탄올 추출을 실시하였다. 알코올 불용성 잔류물은 산성 조건하에서 TGA와 침전 된 리그닌으로 치료되었다. 리닌 표준 곡선은 상업적 대나무 리그닌을 사용하여 생성되었고 회귀 라인(y = mx+c)이 얻어졌다. “x” 값은 280nm에서 리그닌의 평균 흡광도 값을 사용하며, “m” 및 “c” 값은 회귀 라인에서 입력되어 면 식물 바이오매스 샘플에서 알 수 없는 리그닌 농도를 계산합니다. 이 방법은 5단계로 나뉩니다: 1) 식물 시료의 준비; 2) 물과 메탄올로 샘플을 세척; 3) 리그닌을 침전시키는 TGA 및 산으로 펠릿의 치료; 4) 리그닌의 강수량; 및 5) 샘플의 표준 곡선 제제 및 리그닌 함량 추정. 처음 2단계는 주로 식물 재료 제제에 초점을 맞추고 물, PSB(단백질 용해화 완충제) 및 메탄올 추출을 통해 알코올 불용성 물질을 얻습니다. 이어서, TGA(티오글리콜산) 및 HCl로 처리되어 제3상에서 리그닌을 가진 복합체를 형성하였다. 결국, HCl은 280 nm28에서흡광도를 측정하기 위해 수산화 나트륨에 용해된 리그닌을 침전시키는 데 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lignin은 식물 의 성장과 개발에 중요한 역할을하며 최근 바이오 연료, 바이오 에너지 및 바이오 제품 응용 분야에서 광범위하게 연구되었습니다. Lignin은 모든 혈관 식물 이차 세포벽에 저장되는 방향족 화합물이 풍부합니다. 목재 패널 제품, 바이오 분산제, 플릿, 폴리우레탄 폼 및 회로 기판29,30,31의 수지와 같은 여러 산업 응?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 부분적인 지원에 대해 식물및 토양 과학 및 면학과에 감사드립니다.
Materials
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
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